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Previous issue date: 2016-11-28 === Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) === Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) === Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) === The present work had as general objective to perform the genomic annotation of Expressed Sequences
(ESTs) of Litopenaeus vannamei shrimp, available in the database of Project ShEST and to evaluate the
polymorphism of mined SSR and SNP tags. These markers were located in the main chain of protein genes
with function related to performance traits and were validated in SPF (Specific Pathogen Free) shrimp
families submitted to selection for rapid growth and survival. In addition to the EST-SSR and EST-SNP loci,
obtained by Sanger sequencing, Next Generation Sequencing (NGS) analyzes were included in the initial
proposal of work with the objective of expanding the set of SNPs available and verifying the differential gene
expression. The new assembly of ESTs was performed and produced a set of 2.984 unigenes with protein
products for 41% of them, with 1.983 SSRs and 3.472 SNPs being identified. Among the loci with gene
product identified, 231 were enzymes with 127 unique EC numbers inserted in 94 KEGG metabolic pathways.
Loci validation showed that the loci of the 60S ribosomal (SSR-EST) and crustacyanin (SNP-EST) proteins were
polymorphic in the animals sampled from Genearch. Statistical analyzes were conducted to verify the
existence of a possible association between the genotypes and the analyzed weight phenotypes, although
no association was observed. In addition, cross-species amplification tests were performed on seven species
of marine and two freshwater prawns, demonstrating successful transferability for these species. The RNAseq
approach was included in the present work with the purpose of increasing the number of SNPs detected
in candidate genes with performance-related function and identifying differentially expressed (DE) genes in
animals under experimental conditions. A second transcriptome was assembled from the muscle and
hepatopancreas tissues of L. vannamei individuals (i) evaluated for rapid growth and survival and (ii) exposed
to the White Spot Syndrome Virus (WSSV). A total of 63.105 transcripts were generated, with an average
size of 2.511 bp and N50 of 3.464 bp. More than 15.500 SNPs were identified (frequency > 50%). Functional
annotation was also performed on the bases of SwissProt, Gene Ontology (GO) and KEGG. Differential gene
expression analyzes were performed on the animal samples evaluated for growth and response to WSSV
infection. The data generated showed differences in the expression profile between the genes of (i) high and
low growth animals, (ii) the hepatopancreas and muscle and (iii) the uninfected (healthy) and infected (ill)
animals by WSSV, considering the effect of the tissue. Two-hundred and seven DE genes were identified for
growth, 5.816 for hepatopancreas and muscle and 1.017 for ill and healthy animals. === O presente trabalho teve como objetivo geral realizar a anotação genômica de sequências expressas (ESTs)
de Litopenaeus vannamei, disponíveis no banco de dados do Projeto ShEST e avaliar o polimorfismo de
marcas SSR e SNP mineradas. Esses marcadores estavam localizados na cadeia principal de genes de
proteínas com função relacionada a traços de desempenho e foram validados em famílias de camarões SPF
(Specific Pathogen Free) submetidas à seleção para rápido crescimento e sobrevivência. Adicionalmente aos
locos SSR-EST e SNP-EST, obtidos por sequenciamento Sanger, análises de Sequenciamento de Próxima
Geração (NGS) foram incluídas na proposta inicial de trabalho com o objetivo de ampliar o conjunto de SNPs
disponíveis e verificar a expressão gênica diferencial. A montagem de novo das ESTs foi realizada e produziu
um conjunto de 2.984 unigenes com produtos proteicos para 41% destes, sendo identificados 1.983 SSRs e
3.472 SNPs. Dentre os locos com produto gênico identificado, 231 eram enzimas com 127 EC numbers únicos
inseridos em 94 vias metabólicas do KEGG. A validação dos locos SSR-EST e SNP-EST mostrou que os locos
das proteínas 60S ribossomal (SSR-EST) e crustacianina (SNP-EST) apresentaram-se polimórficos nos animais
amostrados da Genearch. Análises estatísticas foram conduzidas para verificação da existência de uma
possível associação entre os genótipos e os fenótipos de peso analisados, embora não tenha sido observada
associação. Além disso, testes de amplificação heteróloga foram realizados em sete espécies de camarões
marinhos e duas de água doce, demonstrando sucesso na transferabilidade para estas espécies. A
abordagem de RNA-seq foi incluída no presente trabalho com o propósito de ampliar o número de SNPs
detectados em genes candidatos com função relacionada a traços de desempenho e identificar genes
diferentemente expressos (DE) em animais sob condições experimentais. Foi realizada a montagem de novo
de um segundo transcriptoma, dos tecidos músculo e hepatopâncreas de indivíduos de L. vannamei (i)
avaliados para rápido crescimento e sobrevivência e (ii) expostos ao vírus da Síndrome da Mancha Branca ou
White Spot Syndrome Virus (WSSV). Foram gerados 63.105 transcritos, com tamanho médio de 2.511 pb e
N50 de 3.464 pb. Foram identificados mais de 15.500 SNPs (frequência > 50%). Também foi realizada a
anotação funcional nas bases do SwissProt, Gene Ontology (GO) e KEGG. Análises de expressão diferencial
gênica foram realizadas nas amostras dos animais avaliados para crescimento e resposta a infecção pelo
WSSV. Os dados gerados demonstraram diferenças no perfil de expressão entre os genes (i) de animais de
alto e baixo crescimento, (ii) do hepatopâncreas e músculo e (iii) dos animais não-infectados (saudáveis) e
infectados (doentes) pelo WSSV, considerando-se o efeito do tecido. Foram identificados 207 genes DE para
crescimento, 5.816 para a comparação entre os tecidos e 1.017 para os animais doentes e saudáveis. === FAPESP: 2012/13069- 6 === FAPESP: 2012/17322-8
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