Estudo das condições de cultivo e de eletrocompetência para a transformação de Bacillus megaterium ATCC 14945

• Main Author: Fonseca, Débora Faria
• Other Authors: Giordano, Raquel de Lima Camargo
• Format: Others
• Language: Portuguese
• Published: Universidade Federal de São Carlos 2016
• Subjects: Biologia molecular; Bactérias - transformação; Eletroporação; Bacillus megaterium; CIENCIAS BIOLOGICAS::BIOQUIMICA::BIOLOGIA MOLECULAR
• Online Access: https://repositorio.ufscar.br/handle/ufscar/6942

Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 1828.pdf: 1894013 bytes, checksum: 47084c725e570d01b5c72cabdaeed953 (MD5) Previous issue date: 2008-03-28 === Financiadora de Estudos e Projetos === The Gram-positive genus Bacillus is of great biotechnological importance. Their ability to secrete enzymes efficiently during fermentation is exploited for the production of extracellular enzymes such as penicillin G acylase (PGA). Bacillus megaterium has proven to be an excellent alternative host to Escherichia coli for heterologous gene expression. Unlike other bacilli strains, proteolytic degradation by alkaline proteases is avoided. In addition, there are no endotoxins found in the cell wall. As a result, protein yields are exceptionally high even if inexpensive substrates are used. In this work, the growth conditions of B. megaterium ATCC 14945 and its preparation for transformation by electroporation with plasmid DNA had been studied. Vegetative cells and protoplasts of B. megaterium had been used. Plasmid DNAs (pET- 32, pETduet-1, pBR322 and pHis 1522) were prepared from E. coli strains DH5α and BL21. Bacteria cultures were growth in Luria-Bertani (LB) broth, Nutrient or LBS (LB containing 0,5 M sorbitol) medium. It had been used the following Electroporation Media: 25% PEG 6000/0.1 M Sorbitol (Moro et al., 1995), 0.625 M Sacarose/1.0 mM MgCl2, pH 5.5 (Dunny et al., 1991), HEPES 10 mM, pH 7.0 (Belliveau & Trevors, 1989) and SMG (0.5 M sorbitol, 0.5 M manitol and 10% glicerol) (Xue et al., 1999). As Recovery Media after electric pulses, LB and LBSM (LB containing 0,5 M sorbitol and 0.38 M manitol) had been used. Extractions of genomic DNA of B. megaterium and plasmid DNA of E. coli had been carried through. The Colonies Forming Units method (CFU) was applied in order to analyze the B. megaterium viability before and after treatment with Electroporation Media. The biomass produced (Cx) was analyzed spectrophotometrically and by the Dry Mass method. The morphology and pureness of B. megaterium cultures had been studied by optic microscopy preparations and B. megaterium growth in liquid selective media. The best electric conditions for electroporation had been established by preliminary tests. B. megaterium transformations was performed according to protocols described by Moro et al. (1995), Dunny et al. (1991), Belliveau & Trevors (1989), Xue et al. (1999) and Romero et al. (2006). The B. megaterium growth curves in LB, Nutrient and LBS had allowed the identification of growth phases of cultures and the respective electric conditions adjustment for electroporation protocols. The cellular concentration (dry mass) found for 16 hours of culture in Nutrient, LB and LBS medium had been 1.900 g/L, 2.649 g/L and 2.320 g/L, respectively. The viable cells concentration analyses (UFC) had allowed the adjustment of plasmid DNA concentrations employed and transformation efficiencies calculation. It had been found the following cellular densities of B. megaterium grown in Nutrient, LB and LBS medium respectively after PEG/Sorbitol Electroporation Medium treatment: 8.8 x 108; 9,2 x 108 and 2.3 x 109 UFC/mL. For Sacarose/MgCl2, it had been found 2,8 x 107; 4.6 x 108 and 3.7 x 108 UFC/mL and for HEPES 5.6 x 108; 2.93 x 109 and 1.86 x 108. For SMG, it had been found 1,7 x 109; 9.4 x 109 and 1.1 x 1010 UFC/mL for Nutrient, LB and LBS medium, respectively. === Bacillus são bactérias Gram-positivas de grande importância biotecnológica. Sua habilidade para secretar enzimas eficientemente durante a fermentação é utilizada para a produção de enzimas extracelulares como penicilina G acilase (PGA). Bacillus megaterium revelou-se excelente hospedeiro alternativo à Escherichia coli para a expressão de genes heterólogos. Diferentemente de outras linhagens de bacilos, a degradação proteolítica por alcalino-proteases não é verificada. Além disso, não são encontradas endotoxinas em sua parede celular. Consequentemente, os rendimentos de produção de proteínas são excepcionalmente elevados, ainda que substratos econômicos sejam utilizados. Neste trabalho, foram estudadas as condições de crescimento de células de B. megaterium e sua preparação para transformação por eletroporação com DNA plasmidial. Foram utilizadas células vegetativas e protoplastos de B. megaterium ATCC 14945 e as linhagens de E. coli DH5α e BL21 (para amplificação e manutenção dos plasmídeos pET-32, pETduet-1, pBR322 e pHis 1522). Os meios de crescimento empregados foram Nutriente, Luria-Bertani (LB) e LBS (LB contendo 0,5 M sorbitol). Para as eletroporações, foram utilizados os Meios 25% PEG 6000/0,1 M Sorbitol (Moro et al., 1995), 0,625 M Sacarose/1,0 mM MgCl2, pH 5,5 (Dunny et al., 1991), HEPES 10 mM, pH 7,0 (Belliveau & Trevors, 1989) e SMG (0,5 M de sorbitol, 0,5 M de manitol e 10% de glicerol) (Xue et al., 1999). Como Meios de Recuperação pós-pulso elétrico, foram utilizados os Meios LB e LBSM (LB contendo 0,5 M de sorbitol e 0,38 M de manitol). Foram realizadas extrações de DNA genômico de B. megaterium e de DNA plasmidial de E. coli; ensaios de viabilidade das células de B. megaterium antes e após tratamento com os diferentes Meios de Eletroporação, pelo Método de Contagem de Unidades Formadoras de Colônias (UFC); quantificação de biomassa produzida (Cx) nos cultivos de B. megaterium nos diferentes Meios, pelo Método da Massa Seca, e acompanhamento por leitura espectrofotométrica (DO 600 nm); análise morfológica e de pureza dos cultivos por meio de preparações permanentes e a fresco e do crescimento de B. megaterium selvagem em diferentes meios seletivos; testes preliminares de eletroporação para estabelecimento das melhores condições elétricas; ensaios de eletroporação segundo os protocolos de Moro et al. (1995), Dunny et al. (1991), Belliveau & Trevors (1989), Xue et al. (1999) e Romero et al. (2006). Foram obtidas as curvas de crescimento de B. megaterium para os Meios de Cultivo Nutriente, LB e LBS. Tais curvas permitiram a identificação da fase de crescimento das culturas e o respectivo ajuste das condições elétricas para os protocolos de eletroporação. As medidas de concentração celular (massa seca) encontradas para 16 horas de cultivo, para culturas crescidas em Meio Nutriente, LB e LBS foram 1,900 g/L, 2,649 g/L e 2,320 g/L, respectivamente. As análises de concentração de células viáveis (UFC) forneceram a densidade celular após tratamento com os diferentes Meios de Eletroporação, de modo a permitir o ajuste das concentrações de DNA plasmidial a serem empregadas e o cálculo das eficiências de transformação. Após o tratamento de células de B. megaterium, crescidas em Meio Nutriente, LB e LBS, com o Meio de Eletroporação PEG/Sorbitol, foram obtidas, respectivamente: 8,8 x 108; 9,2 x 108 e 2,3 x 109 UFC/mL; para o Meio de Eletroporação Sacarose/MgCl2, 2,8 x 107; 4,6 x 108 e 3,7 x 108 UFC/mL; para o Meio de Eletroporação HEPES, 5,6 x 108; 2,93 x 109 e 1,86 x 108; para o Meio de Eletroporação SMG, 1,7 x 109; 9,4 x 109 e 1,1 x 1010 UFC/mL, respectivamente para os Meios de Crescimento Nutriente, LB e LBS.