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Previous issue date: 2005-06-10 === Financiadora de Estudos e Projetos === The ubiquitin system represents a selective mechanism for intracellular
proteolysis in eukaryotic cells that involves the sequential activity of three
enzymes, E1 (Ubiquitin activating enzyme), E2 (Ubiquitin-conjugating
enzyme), and E3 (Ubiquitin-protein ligase). The identification of these
proteins and their targets as well as structural data is essential to
understand their function in the eukaryotic cell. In the present study the
open reading frame of human Ubiquitin- conjugating enzyme UBE2G2 was
isolated from a human brain cDNA panel, cloned into pET28 vector and
expressed in Escherichia coli. His-tagged protein was then purified by
nickel-affinity chromatography and subjected to structural and functional
studies using circular dichroism (CD) and an in vitro ubiquitin-binding
assay, respectively. The affinity chromatography assay rendered
approximately the 27 mg of the soluble recombinant HisUBE2G2 after
expressed in bacteria at low amounts of IPTG (0,1mM) in 3 hours of
induction. The CD spectra of recombinant pure protein showed a secondary
structure content according with the expected for a member of the E2 family
(Ubiquitin-conjugating enzyme), with 35 % of α-Helix, 21 % of β sheets and
23 % of turns. Moreover, purified protein was able to bind ubiquitin
molecules when mixed with a HeLa cell extract during the pull-down assay.
Taken together the results presented in this work allow inferring that
HisUBE2G2 was expressed in their active form. === O Sistema de Ubiquitinação representa o mecanismo de degradação
protéica intracelular mais importantes em todos nas células eucarióticas e
envolve a atividade seqüencial de três enzimas conhecidas como E1, enzima
ativadora de ubiquitina, a E2 enzima conjugante de ubiquitina e a E3 enzima
ligante de ubiquitina. A identificação destas proteínas e seus alvos protéicos,
assim como as obtenções de dados estruturais são essenciais para entender a
função deste sistema dentro da célula eucariótica. No presente trabalho, a fase
de leitura aberta (ORF) do gene humano ube2g2 foi isolado de um painel de
cDNA de cérebro humano, foi clonado no vetor pET28a e expressado em
bactérias Escherichia coli. A proteína de 18,5 kDa em fusão com uma cauda de
histidinas foi posteriormente purificada por cromatografia de afinidade e
submetido a ensaios estruturais e funcionais a traves do medição do CD e a
traves do ensaio de pull-down, respectivamente. A cromatografia de afinidade
rendeu 27 mg de proteína solúvel, logo após de tê-la expressado
heterologamente a baixas concentrações de indutor IPTG 0,1 mM em três horas
de indução. O espectro de CD da proteína purificada mostrou o conteúdo de
estrutura secundaria de acordo ao esperado para um membro típico da família
de enzimas E2, apresentando um 35 % de hélices α, 21 % de folhas β e 23 % de
giros. Alem do mais, a proteína purificada foi capaz de ligar molécula de
ubiquitina quando misturada com um extrato de células HeLa, durante o
ensaio de pull-down. Desta maneira e com esses resultados apresentados aqui
pode se inferir que a proteína humana UBE2G2 foi expressa na sua forma
ativa.
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