Efeitos epigenéticos sobre a diferenciação in vitro de mioblastos e a expressão dos genes CAST e CAPN1 em bovinos

• Main Author: Oliveira, Alexandre de Lima
• Other Authors: Niciura, Simone Cristina Méo
• Format: Others
• Language: Portuguese
• Published: Universidade Federal de São Carlos 2016
• Subjects: Genética; Epigenética; CAPN1; CAST; Tricostatina A; Células satélites; PCR em tempo real; Trichostatin A; Satellite cells; Real time PCR; CIENCIAS BIOLOGICAS::GENETICA
• Online Access: https://repositorio.ufscar.br/handle/ufscar/5547

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6302.pdf: 1873865 bytes, checksum: 9751d8d17780f8f77d9e24a60cc67c6f (MD5) Previous issue date: 2013-09-20 === Financiadora de Estudos e Projetos === Epigenetics can be defined as the study of heritable changes in phenotype without the occurrence of changes in nucleotide sequence. Epigenetic modifications occur by the chemical changes in DNA and their associated proteins, such as DNA methylation and histone acetylation, respectively. Meat tenderness is a trait of great interest worldwide, resulting in the development of the beef livestock sector to produce meat of quality. It is worth to highlight the role of the calpain/calpastatin system on tenderness. Calpain encoded by the CAPN1 gene plays a role in proteolysis posmortem by cleaving proteins from muscle fiber. The calpastatin encoded by the CAST gene, on the other hand, acts controlling this cleavage by blocking the action of calpain. In addition, this system is also involved in myoblast differentiation into myotubes during embryogenesis. This system controls the proteolysis of proteins that constitute the cytoskeleton and the plasma membrane. To mimic the myotube formation during embryogenesis and to study the epigenetic control of CAPN1 and CAST gene expression, satellite cell cultures established from bovine muscle were kept undifferentiated (negative control) or were induced to differentiate by incubation with culture medium containing 2% fetal bovine serum in the absence (positive control) or after treatment with epigenetic modifiers like 5-Aza- 2'-deoxycytidine (Aza, DNA demethylating) for 48 h at 10 &#956;M, and Trichostatin A (TSA, histone acetylating) for 24 h at 50 nM. The results showed no differences (p>0.05) in myoblast rate fusion between Aza, TSA and positive control groups, but there were differences (p>0.05) when these groups were compared to the negative control, which showed lower fusion rates. There was no difference (p>0.05) in cell viability among the four groups, showing that Aza and TSA were not cytotoxic at the used concentrations. Concerning the gene expression, the gene CAST was more expressed (p<0,05) in the positive control group than the negative one; but no differences were seen in the expression (p>0,05) between positive control, 5-Aza-2 - deoxycytidine and Trichostatin A groups. For the CAPN1 gene, no difference was seen in the expression (p>0,05) between negative and positive control groups, but the CAPN1 gene was more expressed (p<0,05) in the 5-Aza-2 -deoxycytidine and Trichostatin A treatments relative to the positive control group. When the expression ratio of CAPN1/CAST were compared between treatments, was seen more expression (p<0,05) in the positive control group both comparing with negative control group and with 5-Aza-2 -deoxycytidine and Trichostatin A treatments. We may conclude that the treatments with the epigenetic modifier agents didn't affect both the bovine myoblast differentiation into myotubes and the CAST gene expression, but did in the CAPN1 gene expression and so did in the expression ratio of CAPN1/CAST. === Epigenetics can be defined as the study of heritable changes in phenotype without the occurrence of changes in nucleotide sequence. Epigenetic modifications occur by the chemical changes in DNA and their associated proteins, such as DNA methylation and histone acetylation, respectively. Meat tenderness is a trait of great interest worldwide, resulting in the development of the beef livestock sector to produce meat of quality. It is worth to highlight the role of the calpain/calpastatin system on tenderness. Calpain encoded by the CAPN1 gene plays a role in proteolysis posmortem by cleaving proteins from muscle fiber. The calpastatin encoded by the CAST gene, on the other hand, acts controlling this cleavage by blocking the action of calpain. In addition, this system is also involved in myoblast differentiation into myotubes during embryogenesis. This system controls the proteolysis of proteins that constitute the cytoskeleton and the plasma membrane. To mimic the myotube formation during embryogenesis and to study the epigenetic control of CAPN1 and CAST gene expression, satellite cell cultures established from bovine muscle were kept undifferentiated (negative control) or were induced to differentiate by incubation with culture medium containing 2% fetal bovine serum in the absence (positive control) or after treatment with epigenetic modifiers like 5-Aza- 2'-deoxycytidine (Aza, DNA demethylating) for 48 h at 10 &#956;M, and Trichostatin A (TSA, histone acetylating) for 24 h at 50 nM. The results showed no differences (p>0.05) in myoblast rate fusion between Aza, TSA and positive control groups, but there were differences (p>0.05) when these groups were compared to the negative control, which showed lower fusion rates. There was no difference (p>0.05) in cell viability among the four groups, showing that Aza and TSA were not cytotoxic at the used concentrations. Concerning the gene expression, the gene CAST was more expressed (p<0,05) in the positive control group than the negative one; but no differences were seen in the expression (p>0,05) between positive control, 5-Aza-2 - deoxycytidine and Trichostatin A groups. For the CAPN1 gene, no difference was seen in the expression (p>0,05) between negative and positive control groups, but the CAPN1 gene was more expressed (p<0,05) in the 5-Aza-2 -deoxycytidine and Trichostatin A treatments relative to the positive control group. When the expression ratio of CAPN1/CAST were compared between treatments, was seen more expression (p<0,05) in the positive control group both comparing with negative control group and with 5-Aza-2 -deoxycytidine and Trichostatin A treatments. We may conclude that the treatments with the epigenetic modifier agents didn't affect both the bovine myoblast differentiation into myotubes and the CAST gene expression, but did in the CAPN1 gene expression and so did in the expression ratio of CAPN1/CAST. === Epigenetics can be defined as the study of heritable changes in phenotype without the occurrence of changes in nucleotide sequence. Epigenetic modifications occur by the chemical changes in DNA and their associated proteins, such as DNA methylation and histone acetylation, respectively. Meat tenderness is a trait of great interest worldwide, resulting in the development of the beef livestock sector to produce meat of quality. It is worth to highlight the role of the calpain/calpastatin system on tenderness. Calpain encoded by the CAPN1 gene plays a role in proteolysis posmortem by cleaving proteins from muscle fiber. The calpastatin encoded by the CAST gene, on the other hand, acts controlling this cleavage by blocking the action of calpain. In addition, this system is also involved in myoblast differentiation into myotubes during embryogenesis. This system controls the proteolysis of proteins that constitute the cytoskeleton and the plasma membrane. To mimic the myotube formation during embryogenesis and to study the epigenetic control of CAPN1 and CAST gene expression, satellite cell cultures established from bovine muscle were kept undifferentiated (negative control) or were induced to differentiate by incubation with culture medium containing 2% fetal bovine serum in the absence (positive control) or after treatment with epigenetic modifiers like 5-Aza- 2'-deoxycytidine (Aza, DNA demethylating) for 48 h at 10 &#956;M, and Trichostatin A (TSA, histone acetylating) for 24 h at 50 nM. The results showed no differences (p>0.05) in myoblast rate fusion between Aza, TSA and positive control groups, but there were differences (p>0.05) when these groups were compared to the negative control, which showed lower fusion rates. There was no difference (p>0.05) in cell viability among the four groups, showing that Aza and TSA were not cytotoxic at the used concentrations. Concerning the gene expression, the gene CAST was more expressed (p<0,05) in the positive control group than the negative one; but no differences were seen in the expression (p>0,05) between positive control, 5-Aza-2 - deoxycytidine and Trichostatin A groups. For the CAPN1 gene, no difference was seen in the expression (p>0,05) between negative and positive control groups, but the CAPN1 gene was more expressed (p<0,05) in the 5-Aza-2 -deoxycytidine and Trichostatin A treatments relative to the positive control group. When the expression ratio of CAPN1/CAST were compared between treatments, was seen more expression (p<0,05) in the positive control group both comparing with negative control group and with 5-Aza-2 -deoxycytidine and Trichostatin A treatments. We may conclude that the treatments with the epigenetic modifier agents didn't affect both the bovine myoblast differentiation into myotubes and the CAST gene expression, but did in the CAPN1 gene expression and so did in the expression ratio of CAPN1/CAST. === A epigenética pode ser definida como o estudo de mudanças herdáveis no fenótipo sem a ocorrência de mudanças na sequência de nucleotídeos. As modificações epigenéticas caracterizam-se por alterações químicas no DNA e em suas proteínas associadas, como a metilação no DNA e a acetilação nas proteínas histonas, respectivamente. A maciez da carne bovina tem ganhado interesse por todo mundo, e o setor pecuário tem se desenvolvido para produzir carne de qualidade que satisfaça a essa demanda. Vale destacar os papéis do sistema calpaína/calpastatina. A calpaína, codificada pelo gene CAPN1, desempenha um papel fundamental na proteólise posmortem pela clivagem de proteínas que constituem a fibra muscular. A calpastatina, codificado pelo gene CAST, por outro lado, age controlando essa clivagem pelo bloqueio da ação da calpaína. Além disso, esse sistema também está envolvido na diferenciação dos mioblastos em miotubos na embriogênese. A ação desse sistema ocorre pela proteólise controlada de proteínas que constituem a membrana plasmática e o citoesqueleto. Para reproduzir a formação de miotubos durante a embriogênese e estudar o controle epigenético na expressão dos genes CAPN1 e CAST, foram estabelecidas culturas de células satélites de músculo bovino, que foram mantidas sem diferenciação (controle negativo) ou foram induzidas à diferenciação, por meio da incubação com meio de cultivo com 2% de soro fetal bovino, na ausência (controle positivo) e após o tratamento com os agentes modificadores epigenéticos como o 5-Aza-2 - desoxicitidina (Aza; desmetilante de DNA), por um período de 48 h á concentração de 10 &#956;M, e Tricostatina A (TSA; acetilante de histona), por um período de 24 h á concentração de 50 nM. Os resultados mostraram que não houve diferenças (p>0,05) no índice de fusão dos mioblastos entre os grupos Aza, TSA e controle positivo, mas que houve diferença (p<0,05) desses grupos em comparação ao controle negativo, que apresentou menor índice de fusão. Também não houve diferença (p>0,05) nas taxas de viabilidade das células entre os grupos, mostrando que o Aza e TSA não foram citotóxicos nas concentrações usadas Em relação à expressão gênica, o gene CAST foi mais expresso (p<0,05) no grupo controle positivo em comparação ao controle negativo; mas não foram observadas diferenças de expressão (p>0,05) entre os grupos controle positivo, 5-Aza-2 -desoxicitidina e Tricostatina A. Para o gene CAPN1, não foi observada diferença (p>0,05) de expressão entre os grupos controle negativo e positivo, mas o gene CAPN1 foi mais expresso (p<0,05) nos tratamentos 5-Aza-2 -desoxicitidina e Tricostatina A em comparação ao grupo controle positivo. Quando a razão de expressão CAST/CAPN1 foi comparada entre os tratamentos, foi observada maior expressão (p<0,05) no grupo controle positivo, tanto em comparação ao grupo controle negativo, quanto aos tratamentos 5-Aza-2 -desoxicitidina e Tricostatina A. Podemos concluir que os tratamentos com agentes modificadores epigenéticos não afetaram a diferenciação de mioblastos bovinos em miotubos e nem a expressão do gene CAST, mas afetaram a expressão do gene CAPN1 e a razão de expressão CAST/CAPN1. === A epigenética pode ser definida como o estudo de mudanças herdáveis no fenótipo sem a ocorrência de mudanças na sequência de nucleotídeos. As modificações epigenéticas caracterizam-se por alterações químicas no DNA e em suas proteínas associadas, como a metilação no DNA e a acetilação nas proteínas histonas, respectivamente. A maciez da carne bovina tem ganhado interesse por todo mundo, e o setor pecuário tem se desenvolvido para produzir carne de qualidade que satisfaça a essa demanda. Vale destacar os papéis do sistema calpaína/calpastatina. A calpaína, codificada pelo gene CAPN1, desempenha um papel fundamental na proteólise posmortem pela clivagem de proteínas que constituem a fibra muscular. A calpastatina, codificado pelo gene CAST, por outro lado, age controlando essa clivagem pelo bloqueio da ação da calpaína. Além disso, esse sistema também está envolvido na diferenciação dos mioblastos em miotubos na embriogênese. A ação desse sistema ocorre pela proteólise controlada de proteínas que constituem a membrana plasmática e o citoesqueleto. Para reproduzir a formação de miotubos durante a embriogênese e estudar o controle epigenético na expressão dos genes CAPN1 e CAST, foram estabelecidas culturas de células satélites de músculo bovino, que foram mantidas sem diferenciação (controle negativo) ou foram induzidas à diferenciação, por meio da incubação com meio de cultivo com 2% de soro fetal bovino, na ausência (controle positivo) e após o tratamento com os agentes modificadores epigenéticos como o 5-Aza-2 - desoxicitidina (Aza; desmetilante de DNA), por um período de 48 h á concentração de 10 &#956;M, e Tricostatina A (TSA; acetilante de histona), por um período de 24 h á concentração de 50 nM. Os resultados mostraram que não houve diferenças (p>0,05) no índice de fusão dos mioblastos entre os grupos Aza, TSA e controle positivo, mas que houve diferença (p<0,05) desses grupos em comparação ao controle negativo, que apresentou menor índice de fusão. Também não houve diferença (p>0,05) nas taxas de viabilidade das células entre os grupos, mostrando que o Aza e TSA não foram citotóxicos nas concentrações usadas Em relação à expressão gênica, o gene CAST foi mais expresso (p<0,05) no grupo controle positivo em comparação ao controle negativo; mas não foram observadas diferenças de expressão (p>0,05) entre os grupos controle positivo, 5-Aza-2 -desoxicitidina e Tricostatina A. Para o gene CAPN1, não foi observada diferença (p>0,05) de expressão entre os grupos controle negativo e positivo, mas o gene CAPN1 foi mais expresso (p<0,05) nos tratamentos 5-Aza-2 -desoxicitidina e Tricostatina A em comparação ao grupo controle positivo. Quando a razão de expressão CAST/CAPN1 foi comparada entre os tratamentos, foi observada maior expressão (p<0,05) no grupo controle positivo, tanto em comparação ao grupo controle negativo, quanto aos tratamentos 5-Aza-2 -desoxicitidina e Tricostatina A. Podemos concluir que os tratamentos com agentes modificadores epigenéticos não afetaram a diferenciação de mioblastos bovinos em miotubos e nem a expressão do gene CAST, mas afetaram a expressão do gene CAPN1 e a razão de expressão CAST/CAPN1. === A epigenética pode ser definida como o estudo de mudanças herdáveis no fenótipo sem a ocorrência de mudanças na sequência de nucleotídeos. As modificações epigenéticas caracterizam-se por alterações químicas no DNA e em suas proteínas associadas, como a metilação no DNA e a acetilação nas proteínas histonas, respectivamente. A maciez da carne bovina tem ganhado interesse por todo mundo, e o setor pecuário tem se desenvolvido para produzir carne de qualidade que satisfaça a essa demanda. Vale destacar os papéis do sistema calpaína/calpastatina. A calpaína, codificada pelo gene CAPN1, desempenha um papel fundamental na proteólise posmortem pela clivagem de proteínas que constituem a fibra muscular. A calpastatina, codificado pelo gene CAST, por outro lado, age controlando essa clivagem pelo bloqueio da ação da calpaína. Além disso, esse sistema também está envolvido na diferenciação dos mioblastos em miotubos na embriogênese. A ação desse sistema ocorre pela proteólise controlada de proteínas que constituem a membrana plasmática e o citoesqueleto. Para reproduzir a formação de miotubos durante a embriogênese e estudar o controle epigenético na expressão dos genes CAPN1 e CAST, foram estabelecidas culturas de células satélites de músculo bovino, que foram mantidas sem diferenciação (controle negativo) ou foram induzidas à diferenciação, por meio da incubação com meio de cultivo com 2% de soro fetal bovino, na ausência (controle positivo) e após o tratamento com os agentes modificadores epigenéticos como o 5-Aza-2 - desoxicitidina (Aza; desmetilante de DNA), por um período de 48 h á concentração de 10 &#956;M, e Tricostatina A (TSA; acetilante de histona), por um período de 24 h á concentração de 50 nM. Os resultados mostraram que não houve diferenças (p>0,05) no índice de fusão dos mioblastos entre os grupos Aza, TSA e controle positivo, mas que houve diferença (p<0,05) desses grupos em comparação ao controle negativo, que apresentou menor índice de fusão. Também não houve diferença (p>0,05) nas taxas de viabilidade das células entre os grupos, mostrando que o Aza e TSA não foram citotóxicos nas concentrações usadas Em relação à expressão gênica, o gene CAST foi mais expresso (p<0,05) no grupo controle positivo em comparação ao controle negativo; mas não foram observadas diferenças de expressão (p>0,05) entre os grupos controle positivo, 5-Aza-2 -desoxicitidina e Tricostatina A. Para o gene CAPN1, não foi observada diferença (p>0,05) de expressão entre os grupos controle negativo e positivo, mas o gene CAPN1 foi mais expresso (p<0,05) nos tratamentos 5-Aza-2 -desoxicitidina e Tricostatina A em comparação ao grupo controle positivo. Quando a razão de expressão CAST/CAPN1 foi comparada entre os tratamentos, foi observada maior expressão (p<0,05) no grupo controle positivo, tanto em comparação ao grupo controle negativo, quanto aos tratamentos 5-Aza-2 -desoxicitidina e Tricostatina A. Podemos concluir que os tratamentos com agentes modificadores epigenéticos não afetaram a diferenciação de mioblastos bovinos em miotubos e nem a expressão do gene CAST, mas afetaram a expressão do gene CAPN1 e a razão de expressão CAST/CAPN1.