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Previous issue date: 2013-10-28 === Financiadora de Estudos e Projetos === Over the recent years, the incidence of human fungal infections has shown a significant increase. Aspergillus fumigatus is a filamentous fungus opportunistic pathogen responsible for many human respiratory diseases, including invasive pulmonary aspergillosis, which is the most serious form of infection . Studies show that A. fumigatus virulence has a multifactorial process associated with its structure, capacity for growth, adaptation to stress conditions, evasion mechanisms of the immune system and ability to cause harm to the host. CWI (via cell wall integrity ) is a signaling cascade activated in yeast cells under conditions of cell wall stress and plays a role in the adaptation of various fungal pathogens in the human host . In many fungi , CWI is triggered by activation of protein kinase C ( PKC ) and that this pathway is associated with the transcription of genes related to maintaining the integrity of the cell wall and its redevelopment. In this work, a mutant Gly579Arg (G579R) was constructed by transformation mediated by inserting a gene replacement cassette comprising a G2044C transversion located in the cysteine-rich domain controller C1B pkcA of A. fumigatus. From the phenotypic analysis of the mutant strain was observed in the involvement of pkcAG579R CWI since the mutant showed high sensitivity to agents such as CR (congo red) and CFW (calcofluor white) . Furthermore, pkcA is also involved in tolerance to oxidative stress caused by paraquat and menadione. Additionally it was found to increase the sensitivity of the mutant pkcAG579R temperature variations as well as the inhibitor of Hsp90 radicicol. Como CWI is related to the transcriptional activation of biosynthetic genes and rugged cell wall (such as glucan synthase, glucanosil chitin synthases and transferases) the abundance of major genes coding for these enzymes was analyzed by RT-PCR in real time. Based on the tests can be α -1 ,3 glucan synthase ( agsA-C ) dependent signaling mediated PkcA for correct expression. Furthermore, genes such as β-1,3 glucan synthase (fksA) glucanosyltransferase (gelA-C) and some chitin synthases (chsB-E-C) appear not to be dependent function and CWI PkcA . These data demonstrated the role of pkcA signaling cascade in the maintenance of cell wall and thermotolerance in A. fumigatus. This work was the first in which a systematic analysis of gene pkcA was conducted in the human opportunistic fungal pathogen A. fumigatus. === Ao longo dos últimos anos, a ocorrência de infecções fúngicas humanas vem apresentando um aumento expressivo. Aspergillus fumigatus é um fungo filamentoso patógeno oportunista responsável por diversas doenças respiratórias humanas, incluindo aspergilose pulmonar invasiva, que é a forma de infecção mais grave. Estudos demonstram que o A. fumigatus possui um processo de virulência multifatorial associado a sua estrutura, capacidade de crescimento, adaptação em condições de estresse, mecânismos de evasão do sistema imune e capacidade de causar danos ao hospedeiro. A CWI (via de integridade da parede celular) é uma cascata de sinalização ativada nas células fúngicas sob condições de estresse de parede celular e desempenha um papel na adaptação de vários fungos patogênicos no hospedeiro humano. Em muitos fungos, CWI é desencadeada através da ativação da proteína quinase C (PKC) sendo que esta via está associada à transcrição de genes relacionados com a manutenção da integridade da parede celular e sua remodelação. Neste trabalho o mutante Gly579Arg (G579R) foi construído através da transformação mediada pela inserção de um cassete de substituição gênica que compreende uma transversão G2044C localizado no domínio regulador rico em cisteína C1B da pkcA de A. fumigatus. A partir da análise fenotípica desse mutante foi possível observar o envolvimento de pkcAG579R na CWI uma vez que a linhagem mutante mostrou alta sensibilidade a agentes como o CR (congo red) e CFW (calcofluor white). Além disso, pkcA está envolvido também na tolerância ao estresse oxidativo causado por menadiona e paraquat. Adicionalmente verificou-se o aumento da sensibilidade da linhagem mutante pkcAG579R à variações de temperatura bem como ao inibidor de Hsp90, radicicol. Como a CWI está relacionada à ativação transcricional de genes de biossíntese e reforço de parede celular (como por exemplo glucanas sintases, quitinas sintases e glucanosil transferases), a abundância dos principais genes que codificam essas enzimas foi analisada através de RTPCR em tempo real. Baseado nos testes pode-se verificar que as α-1,3 glucana sintase (agsA-C) dependem da sinalização mediada por PkcA para sua expressão. Por outro lado, genes como a β-1,3 glucana sintase (fksA), glucanosiltransferases (gelA-C) e algumas quitinas sintases (chsB-C-E) parecem não ser dependente da CWI e da função de PkcA. Esses dados demostraram parte do papel de pkcA na cascata de sinalização da manutenção da parede celular e termotolerância em A. fumigatus. Este trabalho foi o primeiro no qual uma análise sistemática do gene pkcA foi conduzida no fungo patógeno oportunista humano A. fumigatus.
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