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Previous issue date: 2006-12-20 === Universidade Federal de Sao Carlos === Penicillin G acylase (PGA) is an enzyme of major impact in human health for
catalyzing the deacilation of the penicillin G, to yield 6-aminopenicillanic acid (6-
APA), key intermediate in the semi-synthetic antibiotics production. Several
microorganisms produce PGA, but Bacillus megaterium is capable of secreting it to the
medium. PGA from B. megaterium has been studied in DEQ-UFSCar. Xanthomonas
campestris presents in your DNA the genetic sequence that codify acylase penicillin and
tests with a strain of this microorganism from Departamento de Genética e Evolução da
UFSCar showed PGA extracellular production. Studies in PGA production were
initiated with the microorganism stored in DEQ-UFSCar. At the same time, strains of X.
campestris from Coleção de Culturas Tropical (CCT) and Instituto Agronômico do
Paraná (IAPAR) were tested. However, assays with these strains showed little cellular
growth and no enzymatic activity. The microorganism reactivated was send to Fundação
André Toselo for identification. The result showed that the microorganism was Bacillus
megaterium. Therefore, at the same time that realized adaptations tries with the new
strain of X. campestris, studies of production operational conditions of PGA were
performed with strain of Bacillus megaterium, in shaking flasks and bioreactor, as well
the enzyme characterization
Germination/ propagation of B. megaterium experiments, at 30°C, carried out in
shaking flasks showed that the growth time of microorganism in the inoculum step was
24 hours and maximum specific growth rate was µmáx = 0.33h-1. Assays in shaking
flasks were carried out in shaker at 30ºC and 300 rpm intend to determine the most
adequate pH for the enzyme production in both, microorganism propagation phase and
enzyme production phase The results showed that the best pHs among the tested ones
were pH 8.0 and 7.0, for the propagation and production phases, respectively, with 355
IU/L. The culture medium with preferentially consumed amino acids 20,0 g/L,
potassium phenylacetate 3,5 g/L, solution with differents salts 0,22 g/L and cheese
whey 20,0 g/L was the more efficient in PGA production, carried out maximum
cellular growth and enzymatic activity, 4,59 g/L and 592UI/L, respectively, in 36 hours.
Assays in a 2-L bioreactor, with production medium in the presence of amino
acids preferably consumed 10.0 g/L, cheese whey 20.0 g/L, solution of salts 0.22 g/L
and inducer potassium phenylacetate 3.5 g/L, indicated that the addition of nutrients
during the fermentation is a efficient strategy, providing enzyme production increase. In
the study of the influence of oxygen dissolved, carried out in bioreactor too, maximum
enzymatic activity was 451 IU/L with 10% of saturation. Moreover, the maximum
enzyme production was observed in the bioreactor and not in shaking flasks, like in all
experiments until this.
In the stage of characterization of the penicillin G acylase from Bacillus
megaterium, optimum values of temperature and pH were, 47°C and 8.0, respectively.
The Michaelis Menten model fitted resulting in estimated Km and Vmáx parameters
values of 1.51 mM and 1.1*10-3 mmol/min*IU, respectively. The activation energy
estimated was 27.12 KJ/mol.The results showed that PGA from Bacillus megaterium
deactivate completely after 45 minutes of incubation at 60°C and 90 minutes in pH
11.0. === Penicilina G acilase (PGA) é das enzimas de maior impacto na saúde humana,
pois catalisa a desacilação de penicilinas naturais, principalmente a penicilina G, para a
obtenção do ácido 6-aminopenicilânico (6-APA), composto chave na produção de
antibióticos β-lactâmicos. Ela é produzida por diferentes microrganismos, dentre os
quais Bacillus megaterium, um dos poucos que secreta a enzima. A produção de PGA
por esse microrganismo vem sendo estudada há tempos no DEQ-UFSCar. Xanthomonas
campestris possui em seu DNA a seqüência genética que codifica PGA e teste
preliminar de cultivo de linhagem desse microrganismo doada pelo Departamento de
Genética e Evolução da UFSCar mostrou produção extracelular de PGA. Foi iniciado,
por isso, meses depois, estudos de produção de PGA por X.campestris, reativando-se
cultura do microrganismo que estava armazenada no DEQ-UFSCar. Em paralelo, foram
obtidas e testadas outras linhagens desse microrganismo, procedentes da Coleção de
Culturas Tropical (CCT) e do Instituto Agronômico do Paraná (IAPAR). Cultivos
dessas novas linhagens de X. campestris mostraram crescimento celular pequeno, sem
produção de PGA. Comparando-se essas novas linhagens com o microrganismo que se
vinha trabalhando pode-se verificar então que este não era X. campestris. O
microrganismo foi a seguir enviado para identificação na Fundação André Toselo. O
laudo dessa Instituição mostrou que o microrganismo que vinha sendo cultivado era
Bacillus megaterium de Bary 1884AL (ATCC 35985). Esse resultado já era esperado,
pois havia muitas semelhanças entre as duas culturas. Contudo, havia também algumas
diferenças, que motivaram o envio para identificação criteriosa do microrganismo
produtor de PGA. Assim, ao mesmo tempo em que foram realizadas tentativas de
adaptação das novas linhagens de X. campestris visando produção de PGA, foram
investigadas diferentes condições operacionais de produção da enzima com o
microrganismo identificado como B. megaterium, tanto em câmara rotativa shaker
como em biorreator, bem como a caracterização da enzima produzida.
Ensaios de germinação/propagação de Bacillus megaterium, a 30oC, realizados
em shaker , mostraram que o microrganismo atinge fase estacionária em 24 horas, com
velocidade máxima específica de crescimento µmáx = 0,33h-1. O pH inicial onde se
obtém a maior atividade de PGA é 8,0 para o meio de crescimento (propagação) e pH
7,0 para o meio de produção. Cultivos a diferentes temperaturas mostraram que 30ºC é a
temperatura ótima tanto para o crescimento do microrganismo quanto para produção da
enzima. O meio de cultivo composto por aminoácidos consumidos preferencialmente
pelo microrganismo - 20 g/L, fenilacetato de potássio - 3,5 g/L, solução com diferentes
sais 0,22 g/L, e soro de queijo-20,0 g/L mostrou ser o mais eficiente na produção da
PGA, atingindo máxima concentração celular e atividade enzimática, 4,59 g/L e 592
UI/L, respectivamente, em 36 horas de cultivo, com pHs para os meios de crescimento e
produção iguais a 8,0 e 7,0, respectivamente, e temperatura controlada em 30°C.
Cultivos do microrganismo em biorreator de 2 L mostraram que a adição de
nutrientes na forma de pulsos é estratégia eficiente, proporcionando aumento nos níveis
de produção da enzima. Estudo da influência de oxigênio dissolvido na produção de
PGA mostrou que manutenção de 10% de saturação durante todo o cultivo conduz à
máxima atividade enzimática, 451 UI/L. Essa deve ser realmente a condição ótima para
oxigênio, pois pela primeira vez se obteve maior atividade enzimática no biorreator e
não no ensaio em shaker , sempre realizado em paralelo para padronização do estudo. Resultados obtidos na caracterização da enzima confirmaram os valores já
obtidos anteriormente para PGA de B. megaterium: temperatura e pH ótimos foram
47°C e 8,0, respectivamente; parâmetros cinéticos obtidos por ajuste do modelo de
Michaelis-Menten a dados de velocidades iniciais de hidrólise de penicilina G catalisada
por PGA, a 370C, foram: Vmáx 1,1*10-3 mmol/min*UI e Km 1,51 mM; meia-vida da
enzima a 60°C é de 10 minutos, com inativação completa após 45 minutos de
exposição. Quanto à estabilidade alcalina, verificou-se a completa desnaturação de PGA
após 90 minutos de incubação a pH 11,0, com tempo de meia vida de 1 minuto.
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