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Previous issue date: 2004-11-30 === Universidade Federal de Minas Gerais === This work is part of a global project whose aim is the production of a cheese
whey proteins hydrolysate with controlled composition. The process is composed by
sequential hydrolysis of the whey proteins using trypsin, chymotrypsin and
carboxipeptidase A (CPA). The phenylalanine (Phe) and the other aromatic amino acids
released after action of CPA may be removed from the product, providing an adequate
source of proteins for phenylketonurics patients and a final product with more pleasant
flavor. After its separation, a final step of hydrolysis using the non-specific protease
AlcalaseÒ produces a mixture of small peptides with better properties than a mixture of
free amino acids. However, the use of enzymes in industrial processes requests its
immobilization and stabilization. We have studied in this work the first two hydrolysis
stages aiming to reach the following general objectives: to prepare derivatives of trypsin
(on sepabeads, chitosan and agarose) and chymotrypsin (just on agarose), to study the
sequential hydrolysis of the cheese whey proteins with trypsin and chymotrypsin
immobilized on glyoxyl-agarose gel and to investigate the kinetic of the hydrolysis of
these proteins with immobilized chymotrypsin.
Trypsin-sepabeads derivatives were prepared on resins modified with
iminodiacetic acid (IDA) or modified with IDA and copper. Yield of immobilization of
approximately 100% and complete recovery of the enzyme on supports were obtained.
Factors of stabilization in relation to the soluble enzyme from 90 times (Sepabeads-
IDA-Cu2+) to 138 times (Sepabeads-IDA), at 55ºC, were reached and the trypsin-
(Sepabeads-IDA) derivative showed to be more efficient in the casein hydrolysis than
the trypsin-glyoxyl-agarose one.
Trypsin-chitosan derivatives were prepared on coagulated matrices in NaOH
solution (0.1 or 1N) and activated with glutaraldehyde (pH 7 or 10) or glycydol.
Chitosan derivatives whose matrices were activated with glutaraldehyde reached 100%
of yield of immobilization, while the ones activated with glycydol reached just 60%. In
all the studied cases it was possible to recover completelly the enzyme on supports until
the enzymatic load of 20mgEnz./gGel. Derivatives prepared on coagulated matrices in
NaOH 0.1 or 1N and activated at pH 7 resulted in 100% of yield of immobilization and
complete recovery of the enzyme on gel until the enzymatic load of 40mgEnz./gGel. At
40ºC, the glutaraldehyde-chitosan derivatives were approximately 460 times more stable
than the soluble enzyme; at 70ºC, the glyoxyl-chitosan derivative showed to be
approximately 13 times more stable than the glutaraldehyde-chitosan derivative. The
trypsin-chitosan derivatives presented the highest hydrolysis activity at 50ºC and pH 9
(40ºC and pH 9 for the soluble enzyme). The best trypsin-chitosan derivative
(coagulated in NaOH 0.1M and activated at pH 7) showed similar performance to the
soluble enzyme in the hydrolysis of the cheese whey proteins (hydrolysis degree (DH)
of 12%).
Trypsin and chymotrypsin derivatives immobilized on glyoxyl-agarose gel
were prepared following a protocol available in the literature (agarose activated with
glycydol and oxidized with NaIO4 to obtain 75µmoles of aldehyde/mL of gel, at 25oC
and pH 10.05). The factors of stabilization obtained for trypsin (3920 times) and
chymotrypsin (14535 times) are according with results already published and were
confirmed through acid hydrolysis of the soluble enzymes and stabilized derivatives.
These experiments showed that 64.76% and 72.15% of the lysines present in the trypsin
and chymotrypsin, respectively, were involved in the enzyme-support attachment. In
consequence of this stabilization, the derivatives showed maximum hydrolysis activity
of synthetic substrates in temperatures and pH higher than the obtained for the soluble
enzymes (trypsin - 85ºC and pH 11; chymotrypsin - 70ºC and pH 10.5).
Hydrolysis of the cheese whey proteins assays using trypsin were developed
varing the DH from 0 to 12%. After that, the obtained mixtures were hydrolysates with
chymotrypsin and carboxipeptidase A, sequentially, using long times and high enzymes
concentrations. The results showed that removal of Phe of approximately 100% was
obtained in the following conditions: DHtrypsin of 0%, DHchymotrypsin of 12.4%
(3.05mgEnz./mL of solution - 10 hours) and 10 hours of reaction with CPA (200UHPHE/
gProtein), producing 15.5% of peptides with molecular mass (MM) lower than
1046Da.
The kinetic of the hydrolysis of the whey proteins was studied and the
apparent kinetic parameters of the Michaelis-Menten model taking into account
competitive inhibition by the substrate ( app
max V , app
m K and
app
S K ) were calculated by
initial rates method using a derivative with high enzymatic load - 40mgEnz./gGel. In
this work, the substrate concentration was defined in terms of peptides bonds that could
be cleaved by chymotrypsin. The effectiveness factor found for reactions developed in
presence of difusional effects was 0.78. The long-term assays (10 hours) were perfectly
fitted by a model where the first five minutes were described by the first order kinetic
(V=kN) and times higher than five minutes were represented by a function of P/No
(V=f(P/No)). === Obs.:Devido a restrições dos caracteres especias, verifcar resumo em texto completo para download.Este trabalho está inserido em um projeto global que visa a produção de um
hidrolisado de proteínas do soro de queijo com composição controlada. O processo
prevê ação seqüencial de tripsina, quimotripsina e carboxipeptidase A (CPA), remoção
de fenilalanina (Phe) e demais aminoácidos aromáticos liberados após ação da CPA e
hidrólise final com AlcalaseÒ, para obtenção de di e tripeptídeos. A mistura de pequenos
peptídeos resultante possui propriedades melhores do que as de uma mistura de
aminoácidos livres. A remoção da Phe e demais aminoácidos hidrofóbicos desses
hidrolisados viabiliza sua utilização por pacientes portadores de fenilcetonúria, além de
proporcionar sabor mais agradável ao produto final, pois estes têm sabor amargo. O uso
de enzimas em processos industriais requer, contudo, a imobilização e a estabilização
destas. Neste trabalho foram enfocadas as duas primeiras etapas de hidrólise visando
cumprimento dos seguintes objetivos gerais: preparação de derivados de tripsina (sobre
sepabeads, quitosana e agarose) e quimotripsina (apenas sobre agarose), estudo da
hidrólise seqüencial das proteínas do soro com tripsina e quimotripsina imobilizadas
sobre gel glioxil- agarose e investigação da cinética da hidrólise dessas proteínas com
quimotripsina imobilizada sobre agarose.
Derivados tripsina-sepabeads foram preparados usando-se resina modificada
apenas com ácido iminodiacético (IDA) ou modificada com IDA e posteriormente
reagida com cobre. Foram obtidos rendimentos de imobilização de aproximadamente
100% e completa recuperação da enzima nos suportes utilizados, com fatores de
estabilização em relação à enzima solúvel variando de 90 (derivados Sepabeads-IDACu2+)
a 138 vezes (derivados Sepabeads-IDA), a 55ºC. Estudo do desempenho do
derivado tripsina-(Sepabeads-IDA) no fracionamento da caseína mostrou sua maior
eficiência frente ao derivado tripsina-glioxil-agarose.
Derivados estabilizados tripsina-quitosana foram preparados sobre matrizes
coaguladas em solução de NaOH (0,1 ou 1N) e ativadas com glutaraldeído (pH 7 ou 10)
ou glicidol. Para todos os derivados tripsina-quitosana ativados com glutaraldeído
obteve-se 100% de rendimento de imobilização, enquanto que o alcançado pelo
derivado cuja matriz foi ativada com glicidol foi de apenas 60%. Recuperação da
enzima nos géis de 100% foi obtida para todos os suportes estudados até carga de
20mgEnz./gGel. Derivados preparados sobre matrizes ativadas a pH 7,
independentemente da concentração da solução coagulante (NaOH 0,1 ou 1N),
resultaram em 100% de rendimento e total recuperação da enzima no gel até carga
enzimática de 40mgEnz./gGel. Fatores de estabilização em torno de 460 vezes foram
obtidos para derivados tripsina-quitosana-glutaraldeído em relação à enzima solúvel, a
40ºC. A 70ºC, o derivado tripsina-quitosana-glioxil mostrou-se aproximadamente 13
vezes mais estável que derivados tripsina-quitosana-glutaraldeído. Temperatura de 50ºC
e pH 9 foram condições nas quais derivados tripsina-quitosana apresentaram maior
atividade de hidrólise (para a enzima solúvel 40ºC e também pH 9). O melhor derivado
tripsina-quitosana preparado (coagulação em NaOH 0,1N e ativação a pH 7) mostrou
desempenho similar ao da enzima solúvel na hidrólise das proteínas do soro (grau de
hidrólise (GH) de 12%).
Derivados de tripsina e quimotripsina sobre gel glioxil-agarose foram
preparados utilizando-se protocolo disponível na literatura (agarose ativada com glicidol
e oxidada com NaIO4 para obtenção de 75mmoles de aldeído/mL de gel, a 25oC e pH
10,05). Os fatores de estabilização aqui obtidos para tripsina (3920 vezes) e
quimotripsina (14535 vezes) estão em concordância com resultados já publicados. Estes
altos índices de estabilização se devem à formação de ligações multipontuais entre as
enzimas e o suporte, o que pôde ser confirmado pelos resultados obtidos através de
hidrólises ácidas das enzimas solúveis e derivados estabilizados. Esses experimentos
mostraram que 64,76% e 72,15% do total de lisinas presentes na tripsina e na
quimotripsina, respectivamente, estavam envolvidas nas multiligações enzima-suporte.
Em conseqüência disso, os derivados de tripsina e quimotripsina expressaram máxima
atividade de hidrólise dos substratos sintéticos em temperaturas e pHs mais elevados
que os observados para as enzimas solúveis (85oC e pH 11 para tripsina e 70oC e pH
10,5 para quimotripsina).
Estudo da hidrólise seqüencial das proteínas do soro foi realizado variando-se
o grau de hidrólise com tripsina de 0 a 12% e submetendo-se em seguida estes
hidrolisados à ação seqüencial de quimotripsina e CPA, empregando-se nessas duas
últimas etapas tempo reacional prolongado e alta concentração enzimática. Os
resultados obtidos mostraram que conversão em Phe próxima de 100% foi obtida
quando as proteínas do soro foram diretamente hidrolisadas pela quimotripsina,
atingindo-se grau de hidrólise de 12,4% com esta protease (concentração enzimática de
3,05mgEnz./mL de solução - 10 horas) e utilizando-se 200UH-PHE/gProteína nas 10
horas de reação com CPA, o que conduziu à formação de 15,5% de peptídeos com
massa molecular (MM) inferior a 1046Da.
O estudo das velocidades iniciais da hidrólise das proteínas do soro catalisada
pela quimotripsina (derivado com alta carga enzimática 40mgEnz./gGel) forneceu os
parâmetros cinéticos aparentes ap
máx V , ap
m K e ap
S K do modelo de Michaelis-Menten com
inibição pelo substrato, representado em termos de ligações peptídicas hidrolisáveis por
esta enzima. O fator de efetividade determinado para reações na presença de efeitos
difusionais (ensaios realizados com derivado contendo 40mgEnz./gGel) foi de 0,78 e os
dados experimentais de bateladas de longa duração (10 horas) foram perfeitamente
ajustados por um modelo composto onde os cinco primeiros minutos de reação foram
descritos por uma cinética de primeira ordem (equação do tipo kN V = ), uma vez que
neste período as proteínas ainda apresentavam elevada massa molecular e o sistema
estava possivelmente sendo controlado pela difusão externa, e tempos superiores a 5
minutos por uma função de o N P , ou seja, uma equação do tipo ) N P ( f V o = . Esta
última abordagem resultou em excelentes ajustes aos dados experimentais para todo o
período reacional ensaiado, o que é bastante relevante dada a complexidade do sistema
em questão.
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