Mecanismos da endocitose de vicilinas em células epiteliais do intestino médio das larvas do caruncho Callosobruchus maculatus (Coleoptera: Chrysomelidae: Bruchinae)

• Main Author: Kunz, Daniele
• Other Authors: Universidade Federal de Santa Catarina
• Format: Others
• Language: Portuguese
• Published: 2017
• Subjects: Bioquímica; Endocitose; Celulas epiteliais; Proteínas; Gorgulho do feijao-de-corda
• Online Access: https://repositorio.ufsc.br/xmlui/handle/123456789/177772

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2017. === Made available in DSpace on 2017-07-25T04:10:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 346990.pdf: 2039452 bytes, checksum: 2fe568b2e85e5513a8947e7a52ae6d8f (MD5) Previous issue date: 2017 === O transporte de proteínas através do epitélio intestinal dos insetos é ainda pouco conhecido. Há evidências de que vicilina, uma importante proteína de armazenamento de sementes do feijão-de-corda (Vigna unguiculata), é internalizada em larvas do bruquíneo Callosobruchus maculatus. Tem sido relatado que esta globulina de armazenamento interage com proteínas presentes nas membranas microvilares ao longo do trato digestivo das larvas. Na presente Tese, as vias celulares envolvidas na endocitose de vicilina em larvas do caruncho C. maculatus foram estudadas. Vicilina marcada com FITC (purificada a partir de sementes do feijão-de-corda) foi incorporada na dieta das larvas de C. maculatus na concentração fisiológica (0,5% m/m). O destino das globulinas marcadas ou não-marcadas foi monitorado por microscopia confocal, imunohistoquímica e Western blotting. A proteína microvilar de ligação à vicilina foi purificada usando cromatografia de afinidade em uma coluna de vicilina-Sepharose seguida por espectrometria de massa MALDI-TOF. A absorção de vicilinas é um caso de endocitose mediada por receptor. O receptor de vicilina foi purificado e mostrou uma elevada homologia com as proteínas da superfamília SEC14, principalmente a proteína transportadora de ?-tocoferol. Estas proteínas estão presentes no intestino das larvas nas microvilosidades das células epiteliais, associadas a vesículas de endocitose. Vesículas endocíticas e cisternas foram encontradas em toda a extensão das células epiteliais do intestino médio. O tipo de transcitose destas macromoléculas foi confirmado através da utilização de inibidores específicos da via endocítica mediada por clatrina ou via mediada por caveolina. Os inibidores filipina III, nistatina e wortmanina inibiram significativamente a endocitose de vicilina, sugerindo que a via endocítica é principalmente mediada por caveolina. Este trabalho mostrou que a transcitose de vicilina através das células do intestino médio de larvas do inseto C. maculatus é mediada por um membro da família SEC14 homóloga à proteína transportadora de ?-tocoferol. É possível sugerir que vicilina é internalizada por endocitose dependente majoritariamente por caveolina. Em relação à faseolina foi observada dificuldade de internalização pelas larvas de C. maculatus. Estas globulinas favoreceram a geração de espécies reativas de oxigênio, onde o aumento da peroxidação lipídica foi determinado pelo método TBARS e o uso de anticorpos anti malondialdeído e 4- hidroxinonenal.<br> === Abstract : The transport of proteins across the intestinal epithelium of insects is still little known. There is evidence that vicilin, a major storage protein of cowpea seeds (Vigna unguiculata), is internalized in larvae of the bruchid C. maculatus. It has been reported that this storage globulin interacts with proteins present in the microvillar membranes along the digestive tract of the larvae. In the present Thesis, the cellular routes involved in the endocytosis of vicilin in larval C. maculatus was investigated. FITC-labeled vicilin (purified from C. maculatus susceptible seeds of cowpea) were incorporated into the diet of the larvae at physiological concentration (0.5% m/m). The fate of labeled or non-labeled globulins was monitored by confocal microscopy, immunohistochemistry and western blotting. The microvillar vicilin-binding protein was purified by using affinity chromatography on a vicilin-Sepharose column followed by MALDI-TOF mass spectrometry. The absorption of vicilins is a case of receptor-mediated endocytosis. The putative vicilin receptor was purified and showed high homology with proteins from the SEC14 superfamily. These proteins are present in the luminal surface of the midgut cell microvilli and inside these epithelial cells, associated to endocytic vesicles. Endocytic vesicles and cisternae were found throughout the extent of midgut epithelial cells. The type of transcytosis of these macromolecules was confirmed through the use of specific inhibitors of clathrin or caveolin-mediated pathways. The inhibitors filipin III, nystatin and wortmannin significantly inhibited the endocytosis of vicilin, suggesting that the endocytic pathway is mediate mainly by caveolin. In this Thesis it was shown that the transcytosis of vicilin through the midgut cells of larval C. maculatus is mediated by a member of the SEC14 family homologous to the a-tocopherol transfer protein. It is possible to suggest that vicilin is internalized by endocytosis dependent on caveolin. In relation to the phaseolin, it was observed difficulty of internalization by the larvae of C. maculatus. These globulins favor the generation of reactive oxygen species, where the increase of lipid peroxidation was determined by the TBARS method and the use of anti-malondialdehyde and 4-hydroxynenal antibodies.