Desenvolvimento, preparação e aplicação de nanopartículas magnéticas para o carreamento de siRNA para interferência na expressão do gene VEGF em linhagem celular de câncer de mama

• Main Author: Dalmina, Milene
• Other Authors: Universidade Federal de Santa Catarina
• Format: Others
• Language: Portuguese
• Published: 2016
• Subjects: Farmácia; Nanopartículas; Fosfato de calcio; Mamas; Câncer
• Online Access: https://repositorio.ufsc.br/xmlui/handle/123456789/160725

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Farmácia, Florianópolis, 2015. === Made available in DSpace on 2016-04-19T04:13:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 336041.pdf: 3290695 bytes, checksum: c2bff10428a13ab49f61c13dd059c7ca (MD5) Previous issue date: 2015 === O câncer de mama é o segundo tipo de câncer mais frequente, atingindo 1.7 milhões de mulheres no mundo. É caracterizado pelo crescimento e proliferação celular desordenado, podendo ocorrer migração das células tumorais, invasão e metástase para outros tecidos e órgãos. Os tratamentos convencionais para o câncer não atingem somente as células tumorais, mas também os tecidos saudáveis apresentando uma série de efeitos adversos que podem levar a complicações severas. Com o avanço do entendimento da genética do câncer e a identificação de genes alvos, a aplicação do efeito de RNA de interferência (RNAi) apresenta-se como alternativa viável para a melhora do prognóstico. A estratégia anti-angiogênica com a introdução de siRNA contra proteína-chave da angiogênese surge como opção entre os genes alvo superexpressos no câncer de mama. Porém, o sucesso da aplicação de RNAi na terapêutica depende do desenvolvimento de nanocarreadores de siRNA efetivos no transporte e na proteção da molécula contra a rápida degradação na circulação. Desta forma, neste trabalho foram preparados dois tipos de suspensão de nanopartículas carreadoras em diferentes pHs (NP1 e NP2), constituídos de 3 componentes (SPIONs, CaP e copolímero PEG-PAsp) responsáveis por realizar funções distintas desde a formação das nanopartículas até a liberação controlada no citoplasma de células de carcinoma de mama. As nanopartículas foram caracterizadas por espalhamento dinâmico de luz, apresentando diâmetro hidrodinâmico médio entre 120 nm e 140 nm em distribuição por intensidade, e índice de polidispersão (PdI) entre 0,05 e 0,15. A avaliação do tamanho e da morfologia por microscopia eletrônica de transmissão corroborou os resultados de caracterização pela comparação com o histograma em número. As nanopartículas se apresentaram com alto potencial magnético, verificado pela capacidade de magnetização dos mesmos, sugerindo estruturas cristalinas de magnetita e maghemita. De acordo com os estudos de citoxicidade realizados por MTT, ambas NP1 e NP2 não foram citotóxicas em células de câncer de mama MDA-MB 231. A avaliação da eficácia em promover o escape endossomal e entregar o siRNA para o silenciamento foi estudada por microscopia confocal e RT-qPCR. A microscopia confocal confirmou a habilidade dos sistemas nanocarreadores em promover o escape endossomal, enquanto que a partir do ensaio de qPCR foi possível observar a redução da expressão do gene VEGF em cerca de 60% em relação aos controles. Diante deste cenário, as nanopartículas carreadoras NP1 e NP2 apresentam-se como alternativas viáveis para aplicação do efeito de RNA de interferência invivo, devido a sua capacidade de carreamento ativo de siRNA no campo magnético, ausência de citotoxicidade, e eficiência na entrega ao citoplasma celular para o silenciamento do gene VEGF objetivando a terapia anti-angiogênica contra o câncer de mama.<br> === Abstract : Breast cancer is the second most common cancer, affecting 1.7 million women. It is characterized by disordered cell growth and proliferation, tumor cells migration, invasion and metastasis. Conventional cancer treatments affect not only tumor cells but also healthy tissue presenting a series of adverse effects that may lead to severe poisoning. With the advancement of the understanding of the cancer genetics and the identification of target genes, application of interference RNA (RNAi) effect is presented as a viable alternative to a better prognosis. The anti-angiogenic strategy with the introduction of siRNA against key protein of angiogenesis appears as an option between the target genes overexpressed in breast cancer. However, the successful application of RNAi depends exclusively on the development of effective siRNA nanocarriers to transport and to protect the molecule against rapid degradation in the blood circulation. Thus, in this work were prepared two kinds of nanoparticles at different pHs (NP1 and NP2), consisting of 3 components (SPIONs, CaP and PEG-PAsp copolymer) responsible for performing different functions from the formation of nanoparticles to controlled release in the cytoplasm of breast carcinoma cells. The nanoparticles were characterized by dynamic light scattering, with hydrodynamic average diameter between 120 nm and 140 nm by intensity distribution and polydispersity index (PdI) of 0.05 to 0.15. The evaluation of the size and morphology by transmission electron microscopy confirmed the characterization results by comparison with the histogram in number. Nanoparticles presented high magnetic potential, verified by magnetizing capacity thereof, suggesting crystal structures of magnetite and maghemite. According to the cytotoxicity by MTT studies, both NP1 and NP2 are not cytotoxic in the MDA-MB 231 breast cancer cells. The efficacy in promoting endosomal escape and deliver siRNA for silencing was studied by confocal microscopy and RT-qPCR. Confocal microscopy confirmed the ability of nanocarriers to promote endosomal escape, while the qPCR assay was possible to observe a reduction in the expression of VEGF gene in about 60% compared to controls. In this scenario, the NP1 and NP2 nanoparticles are presented as a viable alternative carrier for application in RNA interference in vivo, due to its capacity of carrying siRNA by active targeting with application of a magnetic field, lack ofcytotoxicity, and efficiency in delivery to cell cytoplasm to silencing of VEGF gene with the objective of anti-angiogenic therapy against breast cancer.