Caracterização da proteína Cry1Ab do milho geneticamente modificado mon810 e detecção das possíveis interações com proteínas endógenas de milho

• Main Author: Cánova, Diana Karina Diaz
• Other Authors: Universidade Federal de Santa Catarina
• Format: Others
• Language: Portuguese
• Published: 2015
• Subjects: Agricultura; Mutação (Biologia); Imunoprecipitação; Monomeros; Milho; Melhoramento genético
• Online Access: https://repositorio.ufsc.br/xmlui/handle/123456789/133066

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais, Florianópolis, 2014 === Made available in DSpace on 2015-05-26T04:04:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 333237.pdf: 2953007 bytes, checksum: d47a19328ddecfa298f35cb142d3e1bd (MD5) Previous issue date: 2014 === O milho MON810 tem inserido em seu genoma o gene truncado cry1Ab oriundo da bactéria B. thuringiensis (Bt). O gene cry1Ab produz a proteína inseticida Cry1Ab que confere à planta resistência aos insetos da ordem Lepidoptera. Mas a inserção do gene cry1Ab no milho MON810 foi incompleta, dado que parte da região 3' da construção original não foi integrada no genoma do milho, incluindo o terminador NOS. Neste contexto, o principal objetivo foi detectar as possíveis interações da proteína Cry1Ab com as proteínas endógenas de milho. Neste estudo foram utilizadas folhas de milho MON810 no estádio V2 para a caracterização da proteína Cry1Ab e a detecção de possíveis proteínas ligadas à Cry1Ab. Na caracterização da Cry1Ab, foi quantificada a proteína Cry1Ab no limbo e na bainha das folhas por DAS-ELISA, mostrando que o conteúdo da proteína Cry1Ab no limbo (55,56 ± 6,54µg Cry1Ab/g massa fresca) foi seis vezes maior do que na bainha (10,29 ± 2,42µg /g massa fresca). Para a extração da proteína Cry1Ab os protocolos de Mekawi e Gruber resultaram em maior rendimento de extração da proteína Cry1Ab. Os extratos protéicos de milho MON810 foram analisados por Western Blot. O ensaio evidenciou quatro bandas imunorreativas de 70 kDa, 65 kDa, 39 kDa e 34 kDa correspondentes à proteína Cry1Ab, embora em alguns dos extratos foram detectadas bandas imunorreativas maiores do que 120 kDa em vez da proteína Cry1Ab ativa (70 kDa e 65 kDa). No ensaio de imunoprecipitação foram identificadas 49 proteínas de milho coimunoprecipitadas com a proteína Cry1Ab. De forma similar, o ensaio de Ligand blot mostrou que a proteina Cry1Ab poderia estar ligada com proteinas do milho, especialmente uma de 18 kDa, presente tanto nas plantas transgênicas ou na isolinha. Em conclusão, este estudo encontrou (i) evidencia da interação entre a proteína Cry1Ab e proteínas do milho; (ii) variação na quantidade de proteína Cry1Ab em distintas partes da folha e (iii) quarto formas moleculares distintas (70 kDa, 65 kDa, 39 kDa e 34 kDa) da proteína Cry1Ab, ao invés de uma como indicado pela empresa proponente da tecnologia.<br> === Abstract: The MON810 maize has a truncated version of the cry1Ab gene from Bacillus thuringiensis inserted into its genome. The cry1Ab gene produces the insecticidal protein Cry1Ab that confers on the maize resistance to insects of the order Lepidoptera. The construct used in the genetic transformation of MON810 maize contained the CaMV 35S promoter, the hsp70 intron, the cry1Ab gene and the NOS terminator. However, a truncation at the 3 end of the cry1Ab gene led to the complete loss of the NOS terminator, and insertion of cry1Ab gene was incomplete. In this context, the aim of this work was to detect possible interactions of Cry1Ab protein with endogenous protein maize. This study used MON810 leaves (stage V2) to characterize the Cry1Ab protein and to detect possible interaction of Cry1Ab with endogenous maize proteins. To characterize the Cry protein, it was quantified in lamella and sheath by DAS-ELISA. Cry1Ab protein concentration in lamella (55.56 ± 6,54µg Cry1Ab / g fresh weight) was six times greater than the sheath (10.29 ± 2,42µg / g fresh weight). For the extraction of the Cry1Ab protein, five extraction protocols were compared. The protocols of Mekawi and Gruber gave the highest extraction yields of the Cry1Ab protein. The protein extracts of transgenic maize were analyzed by Western blot. The analysis revealed four immunoreactive bands immunoreactive (70 kDa, 65 kDa, 39 kDa and 34 kDa) corresponding to the Cry1Ab protein, although in some extracts, immunoreactive bands greater than 120 kDa were detected instead of the active Cry1Ab protein (70 kDa and 65 kDa). In addition, in the immunoprecipitation assay there were 49 co-imunoprecipitated proteins from maize with the Cry1Ab protein. Similarly, Ligand blot assay showed that the Cry1Ab protein could be binding with maize proteins, especially an 18 kDa protein which was present in both transgenic and isogenic maize. In conclusion, it was found (i) evidence of interaction between Cry1Ab protein and corn proteins; (ii) variation in the amount of Cry1Ab in distinct part of the leaves, and (iii) four distinct molecular form (70 kDa, 65 kDa, 39 kDa e 34 kDa), instead one indicated by the proponent of the technology.