Estudo do efeito dos derivados de imidas cíclicas sobre os mecanismos de resistência tumoral e apoptose em células de linhagens tumorais

• Main Author: Machado, Karina Elisa
• Other Authors: Universidade Federal de Santa Catarina
• Format: Others
• Language: Portuguese
• Published: 2013
• Subjects: Farmácia; Citotoxidade de mediação celular; Apoptose; Imidas; Cancer -; Tratamento
• Online Access: https://repositorio.ufsc.br/handle/123456789/107137

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Farmácia, Florianópolis, 2013. === Made available in DSpace on 2013-12-05T23:18:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 321634.pdf: 2116644 bytes, checksum: cee06a3868398f6bac4784fc7b33b4c1 (MD5) Previous issue date: 2013 === O câncer foi considerado uma das principais causas de morte no mundo, no ano de 2013, sendo responsável por 7,6 milhões de mortes (cerca de 13% de todas as causas de mortes). Para 2030 estima-se 27 milhões de novos casos. Embora a quimioterapia ainda seja a principal terapia utilizada para o tratamento da doença, a morbidade associada aos quimioterápicos ainda é um obstáculo a ser superado. Dessa forma, a busca por compostos antineoplásicos, que tenham maior eficiência em induzir apoptose nas células tumorais e com insignificantes efeitos colaterais, tornou-se alvo de investigação acadêmica e da indústria farmacêutica. Os compostos derivados de imidas cíclicas vêm sendo descritos como promissores agentes antitumorais. Assim, o objetivo deste estudo foi investigar o efeito dos derivados de imidas cíclicas sobre os mecanismos de resistência tumoral e apoptose sobre células de linhagem de melanoma murino (B16F10), de leucemia mieloide aguda humana (K562) e de leucemia linfoide aguda humana (Jurkat). Inicialmente, foi investigado o efeito citotóxico de nove derivados de imidas cíclicas sobre células de linhagem de melanoma murino (B16F10), e determinado suas CI50. O composto 2 foi o que apresentou melhor atividade citotóxica, com um valor de CI50 de 77,75 ?M (±1,3), por isso, foi selecionado para os demais experimentos. Os resultados mostram que esse composto apresenta atividade citotóxica concentração e tempo dependente, bloqueio das fases S e G2/M do ciclo celular, além do aumento de células na fase sub-G0G1, que sugere morte celular por apoptose. Como esses resultados foram considerados satisfatórios, o composto 2 e sete novos derivados de imidas cíclicas foram selecionados para uma nova triagem em células K562. Nessa nova etapa, o composto 15 demonstrou o melhor efeito citotóxico, por isso foi selecionado para modificações estruturais, que geraram cinco novos derivados (16, 17, 18, 19 e 20). O efeito citotóxico dos compostos (15, 16, 17, 18, 19 e 20) foi avaliado em células de leucemia aguda humana (K562 e Jurkat), e demonstram atividade citotóxica concentração e tempo dependente. Foi avaliado o efeito dos compostos (15, 16, 17, 18, 19 e 20) no ciclo celular, e estes demonstraram um bloqueio do ciclo celular na fase S para células Jurkat e na fase sub-G0/G1, para células K562 e Jurkat. A via de morte também foi avaliada por três diferentes metodologias, e os compostos demonstraram causar morte celular, via apoptose. Com esse conjunto de resultados os compostos 15, 17 e 19 foram selecionados para avaliar o seu efeito sobre o potencialmitocondrial, na expressão das proteínas AIF, Bcl-2, Bax, Fas, caspase-3 ativa, survivina, p53e Ki67. Os resultados demonstraram que os compostos (15, 17 e 19) causaram redução do potencial mitocondrial, aumento da expressão do AIF, diminuição da expressão da proteína antiapoptótica Bcl-2 e aumento da expressão da proteína pró-apoptótica Bax, sugerindo que o mecanismo de indução de apoptose desses compostos envolve a via intrínseca da apoptose. Ainda, nas células Jurkat, os compostos 15 e 17 também ativaram a apoptose pela via extrínseca, evidenciado pelo aumento da expressão do receptor Fas. Além disso, os compostos (15, 17 e 19) causaram aumento da atividade da proteína caspase-3 ativa, diminuição da expressão da proteína antiapoptótica survivina, aumento da expressão da proteína p53 e diminuição na expressão do marcador de proliferação celular Ki67. Também foi avaliado o efeito dos compostos (15, 17 e 19) sobre a expressão do gene abcc1, do fenótipo ABCC1 e do fenótipo LRP nas células K562 e Jurkat, e os resultados mostram que os compostos causaram diminuição da expressão constitutiva do gene abcc1 e da proteína LRP nas células K562 e Jurkat. Em conjunto, os resultados aqui expostos, sugerem que os compostos 15, 16, 17, 18, 19 e 20 causaram bloqueio do ciclo das células K562 e Jurkat, e, consequentemente, diminuição da proliferação celular, o que resulta na indução da apoptose via mecanismo intrínseco e/ou extrínseco, além de inibir os mecanismos de resistência à quimioterapia nessas células através da redução da transcrição do gene abcc1 e pela diminuição da expressão de LRP, Bcl-2 e survivina. <br> === Abstract : In 2008, cancer was considered a major cause of death in the world, accounting for 7.6 million deaths (around 13% of all causes of death). For 2030, 27 million new cases of cancer are estimated. Although chemotherapy is still the main therapy used for the treatment of this disease, the morbidity associated with chemotherapeutic drugs is still an obstacle to be overcome. Thus, the search for new anticancer compounds, with higher efficiency in inducing apoptosis in tumor cells with negligible side effects, has become an important target of the pharmaceutical industry. The compounds derived from cyclic imides have been described as promising with antitumor agents. The aim of this study was to investigate the effects of derivatives of cyclic imides on the mechanisms of tumor resistance and apoptosis in murine melanoma cells (B16F10), human acute myeloid leukemia cells (K562) and human acute lymphoblastic leukemia cells (Jurkat). First we have investigated the cytotoxic effect of nine derivatives of cyclic imides in murine melanoma cells (B16F10), and their IC50 have been calculated. Compound 2 has shown the best cytotoxic activity with an IC50 value of 77.75 ?M (±1.3), therefore, it was selected for further studies. The results have shown that this compound reduced the cell viability in a concentration and time-dependent manner, caused cell cycle arrest in S and G2/M phases and increased the number of cells in the sub-G0G1 phase, suggesting cell death by apoptosis. For these promising results, compound 2 and seven new derivatives of cyclic imides have been selected for a new screening in K562 cells. In this new stage, compound 15 has shown the best cytotoxic effect, so it was selected for structural modifications, which has generated five new compounds (16, 17, 18, 19 and 20). The cytotoxic effects of these compounds (15, 16, 17, 18, 19 and 20) have been evaluated in K562 and Jurkat cells, and they have demonstrated a cytotoxic concentration-and-time-dependent activity. The effects of these compounds (15, 16, 17, 18, 19 and 20) on cell cycle have demonstrated a blockage in S phase for Jurkat cells and in sub-G0/G1 phase in K562 and Jurkat cells. Apoptosis has been evaluated and confirmed by three different methodologies. Based on these results, compounds 15, 17 and 19 have been selected to evaluate their effects on the mitochondrial potential and on the expression of AIF, Bcl-2, Bax, Fas, caspase-3 active, survivin, Ki67 and p53 proteins. These compounds (15, 17, 19) have reduced the mitochondrial potential and have caused increased expression of AIF, decreased expression ofantiapoptotic protein Bcl-2 and increased expression of pro-apoptotic protein Bax, which suggests that the apoptosis caused by the compounds involves the intrinsic pathway. In Jurkat cells, apoptosis caused by compounds 15 and 17 also involves the extrinsic pathway, as it has been evidenced by the increased expression of Fas receptor. Furthermore, the compounds (15, 17, 19) have increased the activity of caspase-3 active and the expression of p53 protein, and they have decreased the expression of antiapoptotic survivin and the cell proliferation marker Ki67 proteins. The effect of these compounds (15, 17, 19) have also been evaluated on abcc1 gene expression, on ABCC1 phenotype and on LRP phenotype in Jurkat and K562 cells. The results have shown that the compounds reduced the constitutive expression of abcc1 gene and the expression of LRP protein in Jurkat and K562 cells. Together, these results suggest that compounds 15, 16, 17, 18, 19 and 20 cause cell cycle blockage in Jurkat and K562 cells and, therefore, decrease cell proliferation, which result in the induction of apoptosis by intrinsic and/or extrinsic pathways and in the inhibition of the resistance mechanisms to chemotherapy in these cells by reducing the transcription of abcc1 gene and by decreasing the expression of LRP, survivin and Bcl-2 proteins.