Ziziphus joazeiro Martius: estudo fitoqu?mico do extrato hidroetan?lico das folhas, fracionamento bioguiado anti-Candida e avalia??o do efeito protetor em modelo de doen?a inflamat?ria intestinal

• Main Author: Souza Neto, Manoel Andr? de
• Other Authors: 81995725072
• Language: Portuguese
• Published: PROGRAMA DE P?S-GRADUA??O EM CI?NCIAS FARMAC?UTICAS 2017
• Subjects: CNPQ::CIENCIAS DA SAUDE::FARMACIA; Ziziphus joazeiro; Flavonoides; Saponincas Candida; Colite
• Online Access: https://repositorio.ufrn.br/jspui/handle/123456789/23707

Submitted by Automa??o e Estat?stica ([e-mail]) on 2017-08-01T13:42:40Z No. of bitstreams: 1 ManoelAndreDeSouzaNeto_DISSERT.pdf: 7004364 bytes, checksum: d76c6630a3cda4c0a9b9a90173056466 (MD5) === Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva ([e-mail]) on 2017-08-07T12:02:49Z (GMT) No. of bitstreams: 1 ManoelAndreDeSouzaNeto_DISSERT.pdf: 7004364 bytes, checksum: d76c6630a3cda4c0a9b9a90173056466 (MD5) === Made available in DSpace on 2017-08-07T12:02:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ManoelAndreDeSouzaNeto_DISSERT.pdf: 7004364 bytes, checksum: d76c6630a3cda4c0a9b9a90173056466 (MD5) Previous issue date: 2016-07-28 === Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico (CNPq) === Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior (CAPES) === A esp?cie Ziziphus joazeiro ? uma planta da Caatinga do Nordeste brasileiro, utilizada como antis?ptico, dentifr?cio, anticaspa, anti-inflamat?rio e antimicrobiano. A maioria dos estudos qu?micos relatou a presen?a de triterpenos nas cascas da esp?cie. Quanto ?s folhas, os estudos fitoqu?micos s?o escassos, envolvendo apenas a triagem fitoqu?mica. At? o momento n?o foram caracterizadas as subst?ncias respons?veis pela atividade antif?ngica das folhas e n?o foi encontrado nenhum estudo que tenha avaliado o seu efeito anti-inflamat?rio em modelo de doen?a inflamat?ria intestinal. Portanto, o trabalho tem como objetivo isolar e caracterizar os marcadores qu?micos do extrato hidroetan?lico das folhas (EHF) e desenvolver um m?todo anal?tico por Cromatografia L?quida de Alta Efici?ncia (CLAE) para quantifica-los. Em paralelo a isso, objetiva-se avaliar a atividade anti-Candida do extrato, fra??es e subst?ncias isoladas de Z. joazeiro, por meio de um fracionamento bioguiado, al?m de avaliar o efeito protetor do EHF em modelo de doen?a inflamat?ria intestinal (colite) induzida por DNBS. O EHF foi preparado por meio de macera??o, o qual foi posteriormente particionado com solventes de polaridade crescente. O extrato e as fra??es foram analisados por rea??es qu?micas cl?ssicas, Cromatografia em Camada Delgada, CLAE e CLAE acoplada a espectr?metro de massas (CLAE-EM), sendo observada a presen?a de saponinas, ?cidos fen?licos, cumarinas, e flavonoides glicosilados derivados de quercetina, canferol e isormanetina ou o seu is?mero, tamarixetina. Por meio das an?lises por CLAE-EM foi poss?vel identificar glicos?deos de quercetina (quercetina-3-O-rutinos?deo, quercetina-3-O-galatos?deo, quercetina-3-O-glicos?deo), canferol (canferol-3-O-rutinos?deo) e isoramnetina ou tamarixetina (isoramnetina ou tamarixetina-3-O-rutinos?deo, isoramnetina ou tamarixetina-3-O-galactos?deo, isoramnetina ou tamarixetina-3-O-glicos?deo). Para o isolamento dos flavonoides majorit?rios, a fra??o acetato de etila foi submetida ? t?cnica de Cromatografia em Contra-Corrente de Alta Velocidade aliada ao refinamento por zona de pH, seguido de cromatografia em coluna de fase reversa e CLAE semipreparativa. Desse processo, foram isolados 3 flavon?is (ZJF1, ZJF2 e ZJF3), os quais foram identificados, pela an?lise conjunta de dados cromatogr?ficos e RMN de 1H, como quercetina-3-O-rutinos?deo, canferol-3-O-rutinos?deo e isoramnetina ou tamarixetina-3-O-rutinos?deo, respectivamente. A partir da determina??o da concentra??o inibit?ria m?nima (CIM) por microdilui??o em caldo, aliada a bioautografia, observou-se que a fra??o butan?lica apresentou maior atividade antif?ngica frente ? Candida glabrata ATCC2001 (CIM = 0,625 mg/mL), e que o processo de concentra??o das subst?ncias hipoteticamente bioativas permitiu obter fra??es com maior atividade anti-Candida in vitro frente a cepas de refer?ncia e cl?nicas. Foi observado que as principais subst?ncias respons?veis s?o as saponinas, e a partir de uma dessas fra??es isolou-se a saponina bacopas?deo X, presuntivamente identificada por an?lises mono e bidimensionais de RMN. A atividade anti-inflamat?ria do EHF foi avaliada em modelo de doen?a inflamat?ria intestinal nas doses de 50, 100 e 200 mg/kg, n?o sendo observado efeito protetor do EHF em rela??o ao grupo controle positivo. Os resultados obtidos s?o in?ditos para a esp?cie e o estudo abre perspectivas para a realiza??o de novas investiga??es envolvendo o uso de flavonoides e saponinas no controle de qualidade e avalia??o da sazonalidade, al?m do estudo do mecanismo de a??o das saponinas das folhas sobre as leveduras do g?nero Candida. === The species Ziziphus joazeiro is a Caatinga plant from Northeast Brazil, used as an antiseptic, dentifrice, anti-dandruff, anti-inflammatory, and antimicrobial. Most chemical studies reported the presence of triterpenes in the bark of the species. Regarding the leaves, the phytochemical studies are scarce, only involving phytochemical screening. The substances responsible for the antifungal activity of leaves have not yet been characterized and no study has evaluated its anti-inflammatory effect in inflammatory bowel disease model. Therefore, this study aims to isolate and characterize the chemical markers of hydroethanolic extract of the leaves (HEL), and develop an analytical method by high-performance liquid chromatography (HPLC) to quantify them. Parallel to this, the study aims to evaluate the anti-Candida activity of the extract, fractions and isolated substances from Z. joazeiro through a bioguided fractionation, and to evaluate the HEL protective effect in a DNBS induced model of inflammatory bowel disease (colitis). The HEL was prepared by maceration, which was further partitioned with increasingly polar solvents. The extract and the fractions were analyzed by classical chemical reactions, Thin Layer Chromatography, HPLC and HPLC coupled to mass spectrometry (HPLC-MS), being observed the presence of saponins, phenolic acids, coumarins and flavonoid glycosides derived from quercetin, kaempferol and isorhamnetin or its isomer, tamarixetin. Through HPLC-MS analysis it was identified quercetin glycosides (quercetin-3-O-rutinoside, quercetin-3-O-galatos?deo, quercetin-3-O-glycoside), kaempferol (kaempferol-3-O-rutinoside) and isorhamnetin or tamarixetin (tamarixetina-3-O-rutinoside, isorhamnetin or tamarixetin-3-O-galactoside, isorhamnetin or tamarixetin-3-O-glucoside). For the isolation of the major flavonoids, the ethyl acetate fraction was subjected to a pH-zone-refining high speed countercurrent chromatography, followed by reversed phase column chromatography and semi-preparative HPLC. In this process, 3 flavonols were isolated (ZJF1, and ZJF2 ZJF3), which were identified by the joint analysis of chromatographic data and 1H NMR as quercetin-3-O-rutinoside, kaempferol-3-O-rutinoside and isorhamnetin or tamarixetin-3-O-rutinoside, respectively. From the determination of the minimum inhibitory concentration (MIC) by broth microdilution, coupled with bioautography, it was observed that the butanol fraction had higher antifungal activity against Candida glabrata ATCC2001 (MIC = 0.625 mg / mL), and the process of concentration of the hypothetically bioactive substances afforded fractions which had more anti-Candida activity in vitro against clinical and reference strains. It was observed that the main substances involved are saponins, and through a saponin rich fraction it was isolated bacopaside X, presumptively identified by one and two-dimensional NMR analyzes. The anti-inflammatory activity of EHF was evaluated in a model of inflammatory bowel disease in doses of 50, 100 and 200 mg / kg and it was not observed protective effect of the HEL compared to the positive control group. The results are novel for the species and the study opens perspectives for new investigations involving the use of flavonoids and saponins in quality control and evaluation of seasonality, besides the study of the mechanism of action of leaves saponins on the Candida genus.