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Previous issue date: 2016-01-26 === Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico - CNPq === Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior (CAPES) === Introdu??o: Este trabalho investigou os efeitos de dois agonistas parciais pept?dicos, UFP-113 e [F/G]N/OFQ(1-13)NH2, e um agonista parcial n?o pept?dico, AT-090, do receptor NOP no comportamento emocional de camundongos, bem como as vias de transdu??o do sinal decorrentes da liga??o destas mol?culas com o receptor NOP. M?todos: Foram utilizados camundongos machos, das linhagens Swiss e CD-1, al?m dos nocautes para o receptor NOP (NOP(-/-)) e seus controles selvagens NOP(+/+). O labirinto em cruz elevado (LCE) foi utilizado para avaliar o efeito dos compostos sobre a ansiedade. O diazepam e os agonistas do receptor NOP, N/OFQ e Ro 65-6570, foram utilizados como controles positivos no LCE. Os camundongos NOP(+/+) e NOP(-/-) foram utilizados na avalia??o da seletividade de a??o dos compostos com efeito do tipo ansiol?tico. O teste da nata??o for?ada (TNF) foi utilizado a fim de se avaliar os efeitos dos compostos sobre o comportamento do tipo depressivo. A nortriptilina e os antagonistas do receptor NOP, UFP-101 e SB-612111, foram utilizados como controles positivos no TNF. As a??es da N/OFQ, UFP-101, SB-612111, UFP-113, [F/G]N/OFQ(1-13)NH2 e AT-090 foram ainda avaliadas no teste de hiperlocomo??o induzida pelo metilfenidato (HIM), onde o valproato foi utilizado como controle positivo. A influ?ncia do UFP-113 e [F/G]N/OFQ(1-13)NH2 na atividade locomotora foi testada no campo aberto. As vias de transdu??o do sinal (prote?na G e ?-arrestina 2) dos agonistas (N/OFQ e Ro 65-6570), do antagonista (UFP-101) e dos agonistas parciais (UFP-113, [F/G]N/OFQ(1-13)NH2 e AT-090) do receptor NOP foram investigadas por meio da avalia??o da transfer?ncia de energia por resson?ncia de bioluminesc?ncia (BRET). Para isso, foram usadas c?lulas co-expressando o receptor NOP acoplado ? luciferase (doador de energia), e a prote?na verde fluorescente (aceptor de energia) acoplada a uma das prote?nas efetoras: prote?na G ou a ?-arrestina 2. Resultados: Diazepam (1 mg/kg), N/OFQ (1 nmol), Ro 65-6570 (0,1 mg/kg) e AT-090 (0,01 mg/kg) apresentaram efeito do tipo ansiol?tico no LCE. Os efeitos do Ro 65-6570 e do AT-090 foram devidos a ativa??o seletiva do receptor NOP, uma vez que ambos foram inativos em camundongos NOP(-/-) expostos ao LCE. Em contraste, UFP-113 e [F/G]N/OFQ(1-13)NH2 foram inativos no LCE. No TNF, nortriptilina (30 mg/kg), UFP-101 (10 nmol), SB-612111 (10 mg/kg), UFP-113 (0,01 e 0,1 nmol) e [F/G]N/OFQ(1-13)NH2 (0,3 e 1 nmol) apresentaram efeito do tipo antidepressivo, diferentemente do AT-090, que foi inativo neste teste. Os efeitos do UFP-113 e do [F/G]N/OFQ(1-13)NH2 foram devidos a ativa??o seletiva do receptor NOP, uma vez que o pr?-tratamento com N/OFQ preveniu o efeito do tipo antidepressivo de ambos. O metilfenidato (MF, 10 mg/kg) induziu hiperlocomo??o nos camundongos expostos ao campo aberto, que foi prevenida pelo valproato (400 mg/kg). A N/OFQ (1 nmol), assim como UFP-113 (0,01-0,1 nmol) e [F/G]N/OFQ(1-13)NH2 (1 nmol), foram capazes em reduzir a hiperlocomo??o induzida pelo MF, sem alterar a locomo??o per se. O efeito do UFP-113 decorreu da ativa??o seletiva do receptor NOP, uma vez que foi inativo em camundongos NOP(-/-) expostos ao teste da HIM. Em contraste, o UFP-101 (10 nmol), assim como SB-612111 (10 mg/kg) e AT-090 (0,001-0,03 mg/kg) n?o alteraram o aumento na locomo??o induzido pelo MF. Tanto o UFP-113 quanto o [F/G]N/OFQ(1-13)NH2 induziram hipolocomo??o nas maiores doses testadas (1 e 3 nmol, respectivamente). In vitro, tanto a N/OFQ quanto o Ro 65-6570, promoveram a intera??o do receptor NOP com a prote?na G e com a ?-arrestina 2 de forma concentra??o-dependente, comportando-se como agonistas plenos do receptor NOP em ambas as vias de transdu??o. O AT-090, UFP-113 e [F/G]N/OFQ(1-13)NH2 promoveram a intera??o do receptor NOP com a prote?na G com efeitos m?ximos significativamente reduzidos em rela??o a N/OFQ. O AT-090 foi capaz de induzir o recrutamento da ?-arrestina 2 novamente com efeitos m?ximos reduzidos em rela??o a N/OFQ, enquanto o UFP-113 e o [F/G]N/OFQ(1-13)NH2 falharam em induzir o recrutamento da ?-arrestina 2. Portanto, AT-090 se comportou como agonista parcial em ambas as vias de transdu??o, enquanto UFP-113 e [F/G]N/OFQ(1-13)NH2 se comportaram como agonistas parciais e antagonistas, respectivamente, nas vias de transdu??o da prote?na G e da ?-arrestina 2. O UFP-101 n?o promoveu o recrutamento da prote?na G, nem da ?-arrestina 2, se comportando como antagonista do receptor NOP em ambas as vias de transdu??o. Conclus?o: Ligantes do receptor NOP que produzem o mesmo efeito na intera??o do receptor NOP com a prote?na G (agonismo parcial), s?o capazes de induzir efeitos opostos no recrutamento da ?-arrestina 2 (agonismo parcial vs antagonismo). Essas diferen?as no recrutamento da ?-arrestina 2 podem promover efeitos distintos sobre a ansiedade e o humor, como foi verificado nos testes comportamentais. Este trabalho corrobora o potencial do receptor NOP como uma ferramenta farmacol?gica inovadora no tratamento de transtornos emocionais. === Introduction: This study aimed to investigate the effects of the two peptide NOP partial agonists (UFP-113 and [F/G]N/OFQ(1-13)NH2) and the non peptide NOP partial agonist (AT-090) in the mouse emotional behavior as well as in the intracellular transduction pathways following the receptor binding. Methods: Male Swiss or CD-1 mice were used in this study together with NOP(+/+) and NOP(-/-) mice. The elevated plus maze (EPM) was used to evaluate the effects of compounds on anxiety-like behaviors. Diazepam and the NOP agonists, N/OFQ and Ro 65-6570, were used as positive controls in the EPM. NOP(+/+) and NOP(-/-) mice were used to evaluate the selectivity of those compounds that induced anxiolytic-like behaviors. The forced swim test (FST) was used to evaluate the effects of compounds on depressive-like behaviors. Nortriptyline and the NOP antagonists, UFP-101 and SB-612111, were used as positive controls in the FST. The effects of N/OFQ, UFP-101, SB-612111, UFP-113, [F/G]N/OFQ(1-13)NH2, and AT-090 were assessed in the methylphenidate-induced hyperlocomotion (MIH) test; in this assay valproate was used as positive control. The G protein and ?-arrestin 2 transduction pathways of NOP receptor agonists (N/OFQ and Ro 65-6570), antagonist (UFP-101), and partial agonists (UFP-113, [F/G]N/OFQ(1-13)NH2, and AT-090) were also evaluated using an innovative assay that measures a bioluminescence resonance energy transfer process. For this, cell lines permanently co-expressing the NOP receptor coupled to luciferase (energy donor), and green fluorescent protein (energy acceptor) coupled to one of the effector proteins (G protein or ?-arrestin 2) were used. Results: Diazepam (1 mg/kg), N/OFQ (1 nmol), Ro 65-6570 (0.1 mg/kg), and AT-090 (0.01 mg/kg) induced anxiolytic-like effect in mice in the EPM. The effects of Ro 65-6570 and AT-090 were selective to NOP receptor. UFP-113 (0.01-1 nmol) and [F/G]N/OFQ(1-13)NH2 (0.1-3 nmol) were inactive in the EPM. In the FST, nortriptyline (30 mg/kg), UFP-101 (10 nmol), SB-612111 (10 mg/kg), UFP-113 (0.01 and 0.1 nmol), and [F/G]N/OFQ(1-13)NH2 (0.3 and 1 nmol) induced antidepressant-like effects, while AT-090 (0.001-0.1 mg/kg) was inactive in this assay. The effects of UFP-113 and [F/G]N/OFQ(1-13)NH2 were selective to NOP receptor. Valproate (400 mg/kg) counteracted methylphenidate (MPH, 10 mg/kg)-induced hyperlocomotion in mice in the open field. N/OFQ (1 nmol), UFP-113 (0.01-0.1 nmol), and [F/G]N/OFQ(1-13)NH2 (1 nmol) were also able to reduce the MPH-induced hyperlocomotion, without changing the locomotor activity per se. The effect of UFP-113 was selective to NOP receptor. The UFP-101 (10 nmol), SB-612111 (10 mg/kg), and AT-090 (0.001-0.03 mg/kg) did not change the hyperlocomotor effect of methylphenidate. In vitro, N/OFQ and Ro 65-6570 behaved as NOP full agonists for G-protein and ?-arrestin 2 pathways. AT-090 behaved as NOP receptor partial agonist for both transduction pathways, while UFP-113 and [F/G]N/OFQ(1-13)NH2 behaved as partial agonists and antagonists of NOP receptor for NOP/G protein and NOP/?-arrestin 2, respectively. UFP-101 behaved as NOP receptor antagonist for both transduction pathways. Conclusion: NOP ligands producing same effects on NOP/G protein interaction (partial agonism), but with opposite effects on ?-arrestin 2 recruitment (partial agonism vs antagonism), can promote different in vivo effects on anxiety and mood as it was observed in the behavioral tests. This work corroborates the potential of NOP receptor as an innovative pharmacological target for the treatment of emotional disorders.
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