Desenvolvimento e valida??o de testes de fluxo lateral para a detec??o de cultivares geneticamente modificados e de aflatoxinas em produtos agr?colas

• Main Author: Evangelista, Vanessa Olinto dos Santos
• Other Authors: 15136469153
• Language: Portuguese
• Published: Universidade Federal do Rio Grande do Norte 2016
• Subjects: CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::BIOQUIMICA; Testes de fluxo lateral; Prote?nas Cry; Testes r?pidos; Detec??o de cultivares GM; Aflatoxinas; Seguran?a alimentar
• Online Access: http://repositorio.ufrn.br/handle/123456789/20879

Submitted by Automa??o e Estat?stica ([e-mail]) on 2016-07-06T20:16:17Z No. of bitstreams: 1 VanessaOlintoDosSantosEvangelista_TESE.pdf: 5760623 bytes, checksum: 180f27b8cf175c05011adf038ebd2e0b (MD5) === Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva ([e-mail]) on 2016-07-07T21:00:30Z (GMT) No. of bitstreams: 1 VanessaOlintoDosSantosEvangelista_TESE.pdf: 5760623 bytes, checksum: 180f27b8cf175c05011adf038ebd2e0b (MD5) === Made available in DSpace on 2016-07-07T21:00:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 VanessaOlintoDosSantosEvangelista_TESE.pdf: 5760623 bytes, checksum: 180f27b8cf175c05011adf038ebd2e0b (MD5) Previous issue date: 2015-12-03 === Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico (CNPq) === Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior (CAPES) === A expans?o agr?cola utilizando cultivares geneticamente modificados (GM) ? fen?meno mundial. Esse fato tem impulsionado a implementa??o de legisla??es regulat?rias para monitorar ? presen?a de variedades GM em culturas agr?colas. Outra importante demanda mundial est? relacionada ao consumo de alimentos contaminados por aflatoxinas. Essas mol?culas constituem um classe de compostos extremamente t?xicos que causam efeitos danosos para a sa?de humana e animal. Por isso, a seguran?a e qualidade dos produtos agr?colas s?o essenciais para os consumidores. Os testes de fluxo lateral s?o m?todos alternativos promissores que podem ser utilizados tanto para a detec??o de prote?nas transg?nicas expressas em culturas GM quanto para a detec??o de compostos t?xicos em alimentos. Essa t?cnica apresenta vantagens adicionais quando comparado aos m?todos convencionais, como: simplicidade, rapidez e baixo custo. Nesse estudo foram desenvolvidos dois testes de fluxo lateral, um para a identifica??o das prote?nas Cry1Ac e Cry8 Ka5 expressas em cultivares de algod?o GM e o outro, para a detec??o de aflatoxinas em produtos agr?colas. O teste, para a detec??o dos cultivares transg?nicos, foi desenvolvido no formato sandwhich. Esse teste foi desenvolvido utilizando os anticorpos monoclonais 1B1 e 5H4, produzidos contra a prote?na Cry1Ac, mas que apresentaram rea??o cruzada para a prote?na Cry8Ka5. O monoclonal anti-Cry1B1 foi conjugado com nanopart?culas de ouro coloidal (40 nm) e utilizados como reagente de detec??o. O monoclonal 5H4 foi adsorvido na membrana de nitrocelulose, na regi?o denominada de linha teste e utilizado como reagente de captura do teste. Na linha controle, foi adsorvido o anticorpo anti-mouse IgG. Esses testes foram validados utilizando amostras de folhas de plantas de algod?o GM ( Bollgard I ? e Planta 50- produzida em nosso laborat?rio) e folhas provenientes de cultivares n?o GM ( Cooker 312). Os resultados demonstraram que esse teste foi capaz de distinguir eficientemente amostras GM de n?o GM. Al?m disso, tamb?m apresentou elevada sensibilidade, sendo capaz de detectar 0,06 ?g das prote?nas respectivas nos cultivares transg?nicos. O teste para a detec??o de aflatoxinas foi desenvolvido no formato competitivo. O anticorpo ?-AFLA 3B6, produzido contra AFB1, apresentou reatividade cruzada contra as aflatoxinas AFB2, AFG1, AFG2 e AFM1 e por isso, foi utilizado para o desenvolvimento das fitas-testes. Nesse teste o anticorpo 3B6 foi conjugado com ouro coloidal (40 nm) e utilizado como reagente de detec??o. O ant?geno AFB1 foi adsorvido na linha teste e utilizado como reagente de captura e o anti-mouse IgG foi imobilizado na linha controle do teste. Para a valida??o, gr?os de soja contaminados com o fungo Aspergillus flavus, foram utilizados. Esses testes tamb?m foram avaliados quanto ? habilidade de detec??o de aflatoxinas em amostras alimentares, incluindo leite e prote?na texturizada de soja. Os resultados demonstraram que a fita eficientemente identificou amostras contendo aflatoxinas. Al?m disso, apresentou sensibilidade de 0,5 ng/mL ou 0,5 ?g/Kg. Os resultados obtidos sugerem que as fitas testes desenvolvidas podem ser utilizadas como m?todo r?pido e de baixo custo para o screening de cultivares GM, expressando as prote?nas Cry1Ac e Cry8Ka5, quanto para a detec??o de aflatoxinas em amostras alimentares. === The expansion of cultivated areas with genetically modified crops (GM) is a worldwide phenomenon, stimulating regulatory authorities to implement strict procedures to monitor and verify the presence of GM varieties in agricultural crops. With the constant growing of plant cultivating areas all over the world, consumption of aflatoxin-contaminated food also increased. Aflatoxins correspond to a class of highly toxic contaminants found in agricultural products that can have harmful effects on human and animal health. Therefore, the safety and quality evaluation of agricultural products are important issues for consumers. Lateral flow tests (strip tests) is a promising method for the detection both proteins expressed in GM crops and aflatoxins-contaminated food samples. The advantages of this technique include its simplicity, rapidity and cost-effective when compared to the conventional methods. In this study, two novel and sensitive strip tests assay were developed for the identification of: (i) Cry1Ac and Cry8Ka5 proteins expressed in GM cotton crops and; (ii) aflatoxins from agricultural products. The first strip test was developed using a sandwhich format, while the second one was developed using a competitive format. Gold colloidal nanoparticles were used as detector reagent when coated with monoclonal antibodies. An anti-species specific antibody was sprayed at the nitrocellulose membrane to be used as a control line. To validate the first strip test, GM (Bollgard I? e Planta 50- EMBRAPA) and non-GM cotton leaf (Cooker 312) were used. The results showed that the strip containing antibodies for the identification of Cry1Ac and Cry8Ka5 proteins was capable of correctly distinguishing between GM samples (positive result) and non-GM samples (negative result), in a high sensitivity manner. To validate the second strip test, artificially contaminated soybean with Aspergillus flavus (aflatoxin-producing fungus) was employed. Food samples, such as milk and soybean, were also evaluated for the presence of aflatoxins. The strip test was capable to distinguish between samples with and without aflatoxins samples, at a sensitivity concentration of 0,5 ?g/Kg. Therefore, these results suggest that the strip tests developed in this study can be a potential tool as a rapid and cost-effective method for detection of insect resistant GM crops expressing Cry1Ac and Cry8Ka5 and aflatoxins from food samples.