Desenvolvimento de métodos imunoquímicos e moleculares para o diagnóstico da neosporose

• Main Author: Sá, Gizele Lima de
• Other Authors: http://lattes.cnpq.br/1784055728920385
• Language: Portuguese
• Published: Universidade Federal de Pelotas 2017
• Subjects: CNPQ::OUTROS; Biotecnologia; Neospora caninum; Nc-p43; Nc-p29; Imunodiagnóstico; Immunodiagnostic
• Online Access: http://repositorio.ufpel.edu.br:8080/handle/prefix/3709

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No presente trabalho foi realizada uma revisão bibliográfica das proteínas envolvidas na interação hospedeiro-parasito utilizadas como alvos vacinais e na aplicação em testes diagnósticos devido a sua especificidade. Dentre as proteínas descritas, os antígenos de superfície Nc-p43 e Nc-p29 são amplamente estudados devido a sua especificidade e capacidade de induzer uma resposta imune protetiva, além de não apresentar reação cruzada com outros parasitos Apicomplexas quando utilizadas em ensaios diagnósticos. Frente a isso, propomos a expressão das proteínas específicas de N. caninum, Nc-p43 e Nc-p29 em sistema procarioto, para avaliar sua antigenicidade frente a soros de animais naturalmente infectados por N. caninum e especificidade quando testados frente a soros de animais infectados por T. gondii. A proteína rNc-p43 foi utilizada na produção de um anticorpo policlonal, que foi purificado, conjugado a peroxidase (HPR) e isotiocianato de fluoresceína (FITC) afim de detectar as proteínas recombinantes e nativas Nc-p43, espectivamente. pAb e pAb/HRP foram capazes de reconhecer rNcp-43, enquanto pAb/FITC se mostrou eficiente na imunomarcação do complexo apical de taquizoítos. Um ensaio imunoenzimático de bloqueio (b-ELISA) foi realizado para avaliar a performance do pAb/HRP como ferramenta de diagnóstico. A porcentagem de inibição média para as amostras de soros positivos e negativos de bovinos com neosporose obteve diferença estatística (P <0,0001). Estes resultados sugerem que o pAb pode ligar-se aos mesmos epítopos da Ncp-43 que os anticorpos anti-N. caninum de amostras positivas testadas. O b-ELISA utilizando o pAb/HRP representa uma opção interessante aos testes de diagnóstico disponíveis para a neosporose, uma vez que menos passos estão envolvidos na sua realização e seu formato evita a reatividade cruzada com anticorpos anti-espécie específicos. Em resumo, este trabalho descreve a clonagem e expressão das proteínas Nc-p43 e Nc-p29 de N. caninum em sistema procarioto, a produção de um anticorpo policlonal monoespecífico contra a proteína recombinante Nc-p43 e a avaliação de sua aplicabilidade como ferramenta no diagnóstico para neosporose. === Neospora caninum is a protozoan phylogenetically related to several coccidia with importance in veterinary medicine. This obligate intracellular parasite causes abortions in cattle and neoromuscular paralysis in dogs. Interaction ligand/receiver are required that allow the parasite explore your ability invasive, being the initial contact mediated for immunodominant surface proteins as Ncp43 and Nc-p29. The study of antigens and recombinant proteins of N. caninum have generated a serie of informations aiming the improvement of diagnosis and differentiation of this protozoan and other agents related to it, especially Toxoplasma gondii.In the present work was carried out a literature review focusing in the proteins involved in host-parasite interaction used as vaccine targets and application in diagnostic tests due to its specificity. Among the described proteins, antigens of surface Nc-p43 and Nc-p29 are widely studied due to their specifity and ability to induzer a protective immunity, and not reported cross reaction with other Apicomplexa parasite when used in trials diagnostics. Furthermore, the expression of specific proteins of N. caninum, Ncp43 and Nc-p29, in prokaryote system, are here described, followed by their evaluating concerning their antigenicity, using sera from animals naturally infected with N. caninum; and their specificity through reaction with sera from animals infected with T. gondii. The rNc-p43 protein was used for polyclonal antibody production in rabbit, purified and conjugated to peroxidase (HPR) and fluorescein isothiocyanate (FITC), in order to detect the recombinant and native Nc-p43, respectivelly. pAb and pAb/HRP were able to recognize rNc-p43, which was evaluated by Dot blot and ELISA assays, while pAb/FITC was able to mark the apical complex of tachyzoites. A blocking enzyme-linked immunosorbent assay (b-ELISA) was performed to evaluate the performance of pAb/HRP as diagnostic tool. The average percentage of inhibition for the positive sera pool and the negative sera pool of cattle neosporosis was significantly different (p <0.0001). These results suggest that pAb may bind to the same epitopes of Ncp43 and anti-N. caninum antibodies positive samples tested. b-ELISA using pAb/HRP is an interesting option for diagnostic tests that are available for neosporosis since fewer steps are involved in their implementation and their shape prevents cross-reactivity with anti-species-specific antibodies. In short, this work describes the cloning and expression of Nc-p43 and Nc-p29 proteins N. caninum in prokaryotic system, to produce a monnoespecific polyclonal antibody against the recombinant protein Nc-p43 and evaluation of its suitability as a tool in diagnosis of neosporosis.