Produção e caracterização de quimeras recombinantes C e D de Clostridium botulinum

• Main Author: Gil, Luciana Aquini Fernandes
• Other Authors: CPF:91985757087
• Format: Others
• Language: Portuguese
• Published: Universidade Federal de Pelotas 2014
• Subjects: botulismo bovino; neurotoxinas botulínicas C e D; vacinas recombinantes; LTB; bovine botulism; botulinum neurotoxins C and D; recombinant vaccines; CNPQ::CIENCIAS AGRARIAS::MEDICINA VETERINARIA
• Online Access: http://repositorio.ufpel.edu.br/handle/ri/2486

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:37:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_luciana_aquini_fernandes_gil.pdf: 1257217 bytes, checksum: 0c4055569b5af0eb817b075544551d2f (MD5) Previous issue date: 2012-08-08 === Bovine Botulism is a lethal intoxication caused by the ingestion of the neurotoxins produced by Clostridium botulinum types C and D that inhibit the release of acetylcholine at the neuromuscular junction leading to death by flaccid paralysis. It produces important economic losses, being a major cause of casualties in cattle in several regions of Brazil. The control of the disease depends on the presence of neutralizing antibodies against botulinum neurotoxins (BONTs) in immunized cattle. Immunization is obtained inoculating toxoids produced from cultures of selected strains of C. botulinum types C and D, whose industrial production has limitations concerning efficiency and productivity. An alternative to the use of these toxoids is the production of recombinant antigens with high levels of purity and antigenicity. The C-terminal fraction of the heavy chain of botulinum neurotoxins has been the main target in the development of recombinant vaccines with promising results. In this work, two recombinant bivalent chimeras for the control of bovine botulism consisting of the neuronal receptor binding domains (NRBDs) of botulinum C and D toxins were efficiently produced in Escherichia coli. They were characterized and evaluated in mice, with promising results. Both the recombinant chimeras rLTB-C-D and rC-D were produced by cloning and expressing a synthetic gene encoding the C-terminal portion of both BONTs. The former also included the preferred codons of the E. coli heat labile enterotoxin B subunit (LTB), a potent humoral immune adjuvant. The levels of expression of the recombinant antigens were satisfactory, yielding approximately 100 mg of each recombinant antigen per liter of culture. An ELISA performed to assess the antigenicity of the molecules showed that both were recognized by sera of immunized mice suggesting the preservation of epitopes with the properties of native BONTs. Both chimeras induced high levels of neutralizing antibodies without undesirable effects. The level of neutralizing antibodies of the groups inoculated with equimolar concentrations of rLTB-C-D and rC-D containing Aluminum Hydroxide as adjuvant were similar, confirming the adjuvant properties of LTB. These results demonstrated that the recombinant chimeras were immunogenic. Sera from mice inoculated with commercial vaccines were also analyzed by ELISA using as antigens rC and rD, corroborating the neutralization. === O botulismo bovino é uma intoxicação letal causada pela ingestão da neurotoxina produzida pelo Clostridium botulinum principalmente dos tipos C e D que atua inibindo a liberação de acetilcolina na junção neuromuscular levando à morte por paralisia flácida, com grande importância econômica e sanitária, sendo uma das principais causas de morte em bovinos adultos no Brasil. O controle imunológico do botulismo bovino depende da presença de anticorpos neutralizantes contra as neurotoxinas botulínicas (NBOTs) no momento da ingestão da toxina pré-formada, por meio de imunização dos animais. Atualmente, a imunização é realizada com toxóides obtidos da detoxificação do extrato de cultivos de cepas selecionadas de C. botulinum dos tipos C e D que apresentam limitações quanto à eficiência e produção. Uma alternativa ao uso dos toxóides clássicos é a produção de vacinas recombinantes usando antígenos específicos de alta pureza e imunogenicidade. A fração C-terminal da cadeia pesada da neurotoxina botulínica tem sido o alvo principal no desenvolvimento de alternativas recombinantes a serem utilizadas como vacinas. Neste trabalho, duas quimeras recombinantes bivalentes compostas pelos domínios de ligação ao receptor neuronal (DLRNs) foram produzidas em Escherichia coli, caracterizadas e avaliadas em camundongos. As quimeras recombinantes rLTB-C-D e rC-D foram produzidas a partir da clonagem e expressão de um gene sintético que codifica a porção C-terminal das NBOTs construído com os códons preferenciais de E. coli e a subunidade B da enterotoxina termolábil de E. coli (LTB), um potente adjuvante da resposta imune humoral. O nível de expressão dos antígenos foi de aproximadamente 100mg de cada antígeno recombinante por litro de cultura. Um ELISA realizado para avaliar a antigenicidade das moléculas mostrou que ambas foram reconhecidas pelos soros padrões, sugerindo conservação de epitopos semelhantes aos dos DLRNs nativos. Ambas as quimeras foram inócuas para os camundongos, os quais não apresentaram lesões no local da inoculação bem como alteração de comportamento. Nos soros dos camundongos inoculados com as quimeras recombinantes foi possível detectar níveis de anticorpos neutralizantes. O grupo inoculado com a rLTB-C-D apresentou nível de anticorpos neutralizantes semelhante ao do grupo rC-D + hidróxido de alumínio confirmando o potencial adjuvante da LTB. As quantidades de antígenos utilizados foram equimolares. Esses resultados demonstram que as quimeras recombinantes foram imunogênicas. Os soros dos camundongos inoculados com as diferentes vacinas também foram analisados por ELISA indireto utilizando rC e rD como antígenos. Os dados obtidos neste ELISA corroboram os dados da soroneutralização.