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Previous issue date: 2008-10-10 === Mycoplasma hyopneumoniae is the etiological agent of porcine enzootic pneumonia (EP),
a respiratory disease responsible for significant economic losses. Commercial
vaccines are widely used in the control of this disease, however, they provide only
partial protection. Besides, their preparation is expensive because of fastidiously
growth of M. hyopneumoniae in vitro. Therefore, the development of alternatives for EP
prophylaxis is important for improving health conditions of pigs. Recombinant DNA
technology can be used to overcome problems with conventional vaccines.
Nevertheless, because of the use of TGA and not TGG to code for tryptophan,
translation of mycoplasmal genes terminates prematurely when cloned in other
bacteria, such as Escherichia coli. Because of this, the number of antigenic proteins
characterized to date in vaccine formulations or immunodiagnostic tests is still
restricted. In this work, 63 genetic fragments were selected, which correspond to 48
sequences coding (CDS) of M. hyopneumoniae. First, an overlap extension-PCR
method for site-directed mutagenesis of M. hyopneumoniae genes was standardized,
aiming at substituting TGA codon by TGG. With this improved method, site-directed
mutagenesis was successfully achieved in 14 M. hyopneumoniae genes. Other selected
genes were amplified by PCR and cloned into Champion pET200D/TOPO®. A
total of 59 genetic fragments were efficiently cloned. From these, 49 had their
proteins expressed in E. coli and 35 were purified by affinity chromatography using Ni-
Sepharose columns (HisTrap ). Immunogenic and antigenic properties of these
proteins were analyzed. For this, the proteins were tested against sera from
hyperimmune and from convalescent pigs through ELISA (enzyme-linked
immunosorbent assay) and Western blot. Nineteen recombinant proteins were
specifically recognized by convalescent pig sera indicates they are expressed during
infection. Immune humoral response against recombinant proteins was evaluated in
BALB/c mice by ELISA. The results showed that antigens induce variable levels of
antibodies, which allows inferring the immunogenicity of each antigen. Sera from
inoculated mice with twenty recombinant proteins were able to recognize the native
protein by ELISA. This study allowed identifying and characterizing new
immunogenic proteins according to their potential for use in diagnostic tests and/or
vaccine. These data represent an important contribution for the development of more
efficient serological tests and a subunit vaccine for controlling M. hyopneumoniae
infections in pigs. === Mycoplasma hyopneumoniae é o agente etiológico da pneumonia enzoótica suína (PES),
uma doença respiratória responsável por significativas perdas econômicas. Vacinas
comerciais são mundialmente utilizadas no controle desta doença, porém
proporcionam apenas proteção parcial. Além disso, são caras devido ao crescimento
fastidioso do M. hyopneumoniae in vitro. Desta forma, o desenvolvimento de
alternativas para a profilaxia da PES é fundamental para a melhoria da sanidade dos
suínos. A tecnologia do DNA recombinante pode ser usada para superar problemas
com as vacinas convencionais. No entanto, pela utilização de códons TGA e não
TGG para codificar o amino ácido triptofano, a tradução de genes de micoplasmas
termina prematuramente quando clonados e expressos em outras bactérias, como
Escherichia coli. Devido a isso, o número de proteínas antigênicas de M.
hyopneumoniae caracterizadas e testadas como vacinas ou em testes de
imunodiagnóstico ainda é restrito. Neste trabalho, 63 fragmentos gênicos foram
selecionados, os quais correspondem a 48 seqüências codificadoras (CDS) de M.
hyopneumoniae. Num primeiro momento, foi padronizado um método de PCR de
sobreposição para mutagênese sítio-dirigida de genes de M. hyopneumoniae,
objetivando a substituição do códon TGA por TGG, na seqüência do DNA. Com esse
método, a mutagênese sítio-dirigida foi realizada com sucesso em 14 genes de M.
hyopneumoniae. Os demais genes selecionados foram amplificados por PCR e
clonados no vetor Champion pET200D/TOPO®. No total, 59 fragmentos gênicos
foram clonados eficientemente. Destes, 49 tiveram suas proteínas expressas em E.
coli e 35 foram purificadas por cromatografia de afinidade em coluna de Ni-
Sepharose (HisTrap ). As propriedades antigênicas e imunogênicas destas
proteínas foram analisadas. Para isso, as proteínas foram testadas contra soro de
suínos convalescentes e soro hiperimune através de ELISA (enzyme-linked
immunosorbent assay) e Western blot. Dezenove proteínas recombinantes foram
reconhecidas especificamente por soro de suínos convalescentes, indicando que
elas são expressas durante a infecção. Resposta imune humoral contra as proteínas
recombinantes foi avaliada em camundongos BALB/c através de ELISA. Os
resultados demonstraram que os antígenos induzem um nível variável de anticorpos,
o que nos permite inferir quanto à capacidade imunogênica de cada antígeno. O
soro dos camundongos inoculados com 20 proteínas foi capaz de reconhecer as
proteínas nativas através de ELISA. Este estudo permitiu identificar e caracterizar
novas proteínas imunogênicas de acordo com o seu potencial para uso em testes de
diagnóstico e/ou vacina. Estes dados representam uma importante contribuição para
o desenvolvimento de testes sorológicos mais efecientes e vacinas de subunidade
para o controle da infecção causada por M. hyopneumoniae em suínos.
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