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DISSERTAÇÃO Franz de Assis Graciano dos Santos.pdf: 4554992 bytes, checksum: c66c9124f25e700f6bc29151f2450b37 (MD5) === Made available in DSpace on 2018-06-20T19:45:57Z (GMT). No. of bitstreams: 2
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Previous issue date: 2017-02-23 === CNPQ === Os biofilmes microbianos são comunidades de microrganismos irreversivelmente aderidos a uma superfície que produzem substância polimérica extracelular, a formação de biofilme é relevante devido à contínua liberação de microrganismos que o compõe, os quais mostram fenótipo diverso daquele encontrado na forma planctônica. Candida parapsilosis, atualmente dividida em três espécies distintas, apresentam notória capacidade de formação de biofilmes em cateteres e outros dispositivos implantados. Assim, este trabalho teve objetivos determinar a ação antifúngica e antibiofilme in vitro e in vivo, isolada e sinérgica, de fluconazol e ácido acetilsalicílico frente a modelo experimental de endocardite por espécies do complexo C. parapsilosis. Os isolados foram revisados e caracterizado morfisiologicamente e por técnicas proteômicas. Assim, 20 isolados fenotipicamente classificados como C. parapsilosis foram reclassificados. A atividade antifúngica das drogas foi determinada seguindo as condições descritas no documento M27-S4 do Clinical Laboratory Standards Institute. A Concentração Inibitória Fracionária (FIC) foi avaliada através das combinações de Ácido Acetilsalicilico, fluconazol e Anfotericina B, usando o método de diluição chequerboard. Na sequência Os testes de aderência foram baseados nos trabalhos de Kimura e Pearsall, 1978. Os biofilmes foram preparados usando-se o modelo de placa de microtitulação e quantificados por metodologia colorimétrica do ensaio de redução de hidróxido de tetrazolium (XTT) para avaliação da viabilidade celular, antes e após tratamento. Adicionalmente, empregou-se o uso de microscopia eletrônica de varredura para observação da arquitetura dos biofilmes do complexo C. parapsilosis. O desafio experimental e avaliação clínica, seguiu o modelo murino neutropênico descrito por Craig e Andes 2008 e foi usado para gerar candidíase disseminada e com consequente endocardite. As técnicas proteômicas empregadas distinguiram os isolados como C. parapsilosis stricto sensu (80%), C. metapsilosis (10%) e C. orthopsilosis (10%), das quais 100% foram capazes de formar biofilme, mesmo apresentando fraca adesão as células epiteliais. Testes de sensibilidade frente aos agentes antifúngicos (fluconazol e anfotericina B) demostraram que todas as cepas do complexo C. parapsilosis foram sensíveis. Ácido acetilsalicílico e Fluconazol apresentaram ação sinérgica frente a todas cepas testadas, padrões de antagonismo e de indiferença foram observados quando utilizado fluconazol e anfotericina B, e ácido acetilsalicílico e anfotericina B. O ensaio de redução de XTT demostrou que todas os isolados formaram biofilmes independente das suplementações e em todos tempos testados. Na atividade anti-biofilme podemos observar uma redução significativa na formação de biofilme por espécies do complexo C. parapsilosis, quando utilizado fluconazol e ácido acetilsalicílico de forma combinada. No desafio experimental, a cepa selecionada para modelo de infecção foi a URM 7434 C. orthopsilosis, por apresentar melhor produção de biofilme, menores CIMs, melhor resposta ao tratamento proposto e melhor resposta aos testes pilotos in vivo, os grupos de tratamento, principalmente os que fizeram uso de fluconazol e ácido acetilsalicílico de forma combinada conseguiram debelar a infecção no sétimo dia de tratamento, sem apresentar recidiva até 28º dia de sobrevida. Neste sentido o conhecimento acerca das espécies do complexo C. parapsilosis, além da expressão dos fatores de virulência e perfil de sensibilidade antifúngica, norteiam e viabilizam a conduta terapêutica adequada para tratamento e cura. === Microbial biofilms are microorganisms communities irreversibly adhered to a surface that produce extracellular polymeric substance, the formation of biofilm is relevant due to the continuous release of microorganisms that compose it which show phenotype different from that found in the planktonic form Candida parapsilosis, currently divided into three distinct species, have a remarkable ability to form biofilms in catheters and other implanted devices. The aim of this study was to determine the antifungal and antibiofilm action in vitro and in vivo, isolated and synergistic with fluconazole and acetylsalicylic acid against an experimental model of endocarditis by C. parapsilosis complex. The isolates were reviewed and characterized morphologically and proteomic techniques. Thus 20 isolates phenotypically classified as C. parapsilosis were reclassified. The antifungal activity of the drugs was determined following the conditions described in document M27-S4 of the Clinical Laboratory Standards Institute. Fractional Inhibitory Concentration (FIC) was evaluated by the combinations of Acetylsalicylic, fluconazole and amphotericin B using the dilution method checkerboard. The adhesion tests were based on the work of Kimura and Pearsall, 1978. Biofilms were prepared using the microtiter plate model and quantified by tetrazolium hydroxide reduction (XTT) colorimetric methodology for viability evaluation before and after treatment. In addition, scanning electron microscopy was used to observe the architecture of the C. parapsilosis complex biofilms. The experimental challenge and clinical evaluation followed the murine neutropenic model described by Craig and Andes 2008 and was used to generate disseminated candidiasis and with consequent endocarditis. The proteomic techniques used in this study distinguished C. parapsilosis stricto sensu (80%), C. metapsilosis (10%) and C. orthopsilosis (10%), 100% of which were able to form biofilms, Epithelial cells. Sensitivity tests against antifungal agents (fluconazole and amphotericin B) demonstrated that all strains of the C. parapsilosis complex were sensitive. Acetylsalicylic acid and fluconazole showed synergistic action against all strains tested patterns of antagonism and indifference were observed when using fluconazole and amphotericin B and acetylsalicylic acid and amphotericin B. The XTT reduction assay showed that all isolates formed biofilms independent of supplements and at all times tested. In the anti-biofilm activity we can observe a significant reduction in biofilm formation by species of C. parapsilosis complex, when used fluconazole and acetylsalicylic acid in combination. The experimental challenge, the selected strain for the infection model was URM 7434 C. orthopsilosis because it presented better biofilm production, lower MICs, better response to the proposed treatment and better response to in vivo pilot tests treatment groups, especially Who used fluconazole and acetylsalicylic acid in combination, were able to control the infection on the seventh day of treatment, without relapse up to the 28th day of survival. In this sense, the knowledge about the species of the C. Parapsilosis complex, in addition to the expression of the virulence factors and the antifungal sensitivity profile, guide and enable the appropriate therapeutic management for treatment and cure.
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