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Previous issue date: 2017-03-22 === CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior === Hidroxicloroquina (HCQ), classicamente empregado no tratamento da malária e de doenças autoimunes, tem sido proposta como fármaco de escolha para outros fins terapêuticos. Entretanto, este fármaco é conhecido por causar efeitos colaterais, como distúrbios visuais, que podem ser irreversíveis, sendo que os mecanismos que levam a essas desordens não são completamente conhecidos. A toxicidade produzida na retina pelo uso da HCQ pode ser devida a sua alta taxa metabólica, sendo o tecido muito susceptível à ação de xenobióticos e danos oxidativos. Assim, este trabalho tem como objetivo avaliar os efeitos do fármaco HCQ sobre células da retina, bem como seus possíveis mecanismos de citotoxicidade. Como modelo de estudo, utilizamos culturas de células da retina de embrião de galinha. Para avaliar a viabilidade celular foi usado o ensaio de medida de atividade mitocondrial por MTT. A função lisossomal foi avaliada pela taxa de incorporação do corante vermelho neutro. Os níveis de espécies reativas de oxigênio geral e de ânion superóxido foram avaliados pela sonda CellROX e por Nitro Blue Tetrazolium (NBT), e os níveis de glutationa total foram quantificados usando o reagente de Ellman. A viabilidade foi testada em culturas mistas (glia e neurônios), ou culturas enriquecidas com neurônios ou glia, após tratamento com HCQ. Para comparação foi utilizado a cloroquina (CQ), fármaco da qual a HCQ é derivada. As células foram expostas às concentrações de 25μM, 50μM e 75μM por 24 horas. Os resultados demostram que culturas mistas tratadas com CQ apresentaram redução na viabilidade de 36 e 61% para as concentrações de 50μM e 75μM, respectivamente, enquanto HCQ não altera a viabilidade em nenhuma das concentrações testadas. No entanto, quando culturas enriquecidas com células gliais foram expostas a HCQ por 24 horas, a concentração de 75μM teve uma pequena redução na viabilidade das células, sendo as reduções nas células neuronais mais acentuadas, 20, 33 e 56% para as concentrações de 25μM, 50μM e 75μM, respectivamente. Mesmo um tempo menor de tratamento (6 horas) causou perda de viabilidade em neurônios retinianos. A capacidade de incorporação do corante supravital vermelho neutro, também foi alterada em culturas neuronais tratadas com HCQ por 24 horas, tendo redução de 19 e 32%, comparadas ao controle, para as concentrações de 50μM e 75μM, respectivamente. HCQ reduziu significativamente os níveis de espécies reativas de oxigênio produzidas pelas células neuronais, principalmente ânion superóxido, 43, 52 e 61% para as concentrações de 25μM, 50μM e 75μM de HCQ em 24 horas de tratamento, respectivamente. Os níveis de glutationa total em células neuronais apresentaram redução de 37 e 53% quando tratados com 50μM e 75μM de HCQ por 24 horas, respectivamente, comparado ao controle. Quando o meio condicionado de células gliais foi utilizado em células neuronais tratadas com HCQ por 6 horas, este reverteu completamente o processo de citotoxicidade causado pelo fármaco. E quando os níveis de glutationa total foram mensurados em culturas enriquecidas com glia, tratadas com HCQ por 24 horas, não foram observadas quaisquer alterações. Estes resultados sugerem ação citotóxica de CQ em cultura mista de células da retina de embrião de galinha, o que não é observado no tratamento com HCQ. Entretanto, HCQ mostrou ação citotóxica quando as células são cultivadas separadamente, principalmente sobre neurônios, que é revertida por algum fator liberado pelas células gliais no ambiente extracelular, sendo a glutationa uma possível candidata a exercer essa função neuroprotetora. === Hydroxychloroquine (HCQ) is currently used in the treatment of malaria and autoimmune diseases and others therapeutic purposes. However, this drug is known to cause side effects, including producing visual disturbances, which may be irreversible. The mechanisms that produce these visual disorders are not completely known. HCQ - related retinal toxicity may be due to high metabolic rate, being very susceptible to the action of xenobiotics and oxidative damages. Thus, this work aims to evaluate the effects of the HCQ on retinal cells, as well as their possible mechanisms of cytotoxicity. The model used in this work was of cultures of retina cells from chicken embryo. To evaluate cell viability, mitochondrial activity was measured by MTT. The lysosomal function was evaluated by the incorporation rate of the neutral red dye. The levels of reactive species of general oxygen and superoxide anion were evaluated by the CellROX probe and by Nitro Blue Tetrazolium (NBT) and total glutathione levels were quantified using the Ellman reagent. Viability was tested in mixed cultures (glia and neurons) or enriched cultures of neurons and glia after treatment with HCQ and compared with chloroquine (CQ). Cells were exposed to concentrations of 25μM, 50μM and 75μM for 24 hours. The results show that mixed cultures treated with CQ presented a reduction in viability of 36 and 61% at concentrations of 50μM and 75μM, respectively, whereas HCQ did not alter viability at any of the concentrations tested. However, when cultures enriched with glial cells were exposed to HCQ for 24 hours, the concentration of 75μM had a small reduction in cell viability, while that the reduction in neuronal cells was of 20, 33 and 56% at the concentrations of 25μM, 50μM and 75μM, respectively. Even a shorter treatment time (6 hours) there was loss of viability in retinal neurons. The incorporation of neutral red supravital dye was also altered in neuronal cultures treated with HCQ for 24 hours, with reduction of 19 and 32%, compared to the control for the concentrations of 50μM and 75μM, respectively. HCQ significantly reduced the levels of reactive oxygen species produced by the neuronal cells, mainly superoxide anion, 43, 52 and 61% for the concentrations of 25μM, 50μM and 75μM of HCQ in 24 hours of treatment, respectively. In concentrations of 50μM and 75μM of HCQ for 24 for hours, the levels of total glutathione in neuronal cells presented a reduction of 37 and 53%, respectively. When the glial cell conditioned medium was used in neuronal cells for 6 hours after treatment with HCQ, it completely reversed the drug-induced cytotoxicity. When total glutathione levels were measured in culture of glia treated with HCQ for 24 hours no changes were observed. These results suggest cytotoxic action of CQ in mixed culture of chicken embryo retina cells which is not observed in HCQ treatment. However, HCQ showed cytotoxic action when cells are cultured separately, mainly on neurons, which is reversed by some factor released by glial cells in the extracellular environment, and glutathione is a possible candidate to exert this neuroprotective function.
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