Diagnóstico e filogenia molecular dos vírus da febre amarela a partir de amostras humanas negativas para os vírus dengue

• Main Author: Duarte, Tharlley Rodrigo Eugenio
• Other Authors: Moreli, Marcos Lázaro
• Format: Others
• Language: Portuguese
• Published: Universidade Federal de Goiás 2018
• Subjects: Análise molecular; Árvore filogenética; NS5; Molecular analysis; Phylogenetic tree; CIENCIAS DA SAUDE
• Online Access: http://repositorio.bc.ufg.br/tede/handle/tede/8475

Submitted by Luciana Ferreira ([e-mail]) on 2018-05-15T11:01:10Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Tharlley Rodrigo Eugenio Duarte - 2018.pdf: 3238895 bytes, checksum: 4372ea2b66d739dd3a82a02b57e2b24a (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) === Approved for entry into archive by Luciana Ferreira ([e-mail]) on 2018-05-15T12:24:47Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Tharlley Rodrigo Eugenio Duarte - 2018.pdf: 3238895 bytes, checksum: 4372ea2b66d739dd3a82a02b57e2b24a (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) === Made available in DSpace on 2018-05-15T12:24:47Z (GMT). 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Precisely because of this factor and others involved the diagnosis of YF is not made in the health system except by a relevant suspicion. The problem is that in many cases viruses go unnoticed in cases of Dengue virus infection because of cross reactivity between members of the genus Flavívirus or because of non-specific symptoms. The present study analyzed 118 samples that were screened for suspected Dengue Virus infections (VDEN) for the year 2011 to 2013, but discarded for this virus because they gave negative results to the viral agent through serological and molecular tests in the municipality of Goiânia, Goiás. Samples were sent to the Virology Laboratory of the Federal University of Goiás Regional Jataí and analyzed by molecular methods such as RT-PCR and Nested-PCR followed by verification of the amplicon by agarose gel electrophoresis. Among the 118 negative samples for the DENV virus, three of the samples were positive for the Yellow Fever Virus (YVF) according to the production of amplicons of 253 bp of the NS5 region and confirmation of the identity of the amplicon by nucleotide sequencing. The sequences obtained were submitted to BLAST for identity confirmation. The translated sequence was analyzed by MEGA software version 7.0. For phylogenetic analysis, the best model was previously determined and then the tree was constructed with 53 sequences of all Yellow Fever viruses present in databases for a comparative analysis. The sequences found were compared to sequences from the VFA recorded in the Genbank database and were identified as referring to a portion of the NS5 nonstructural protein, position 216 to 296 of this protein, conferring 81 amino acids. The representative tree demonstrated that the sequences submitted were directly related to Senegal taxa. The robustness of the phylogenetic method was by Bootstrap 2000 replicates using the best JTT + G model, Maximum Likelihood. The Tajima test applied yielded a value of D = 1.159570, thus demonstrating that there was no population expansion of the taxa analyzed, considering that they have a significant degree of conservation during evolution. From the results obtained in the study, it can be affirmed that there was already an YFV circulation in the year 2013, at least of patients seen in the central region of Brazil, even before the last outbreak in 2017. === O Brasil é o maior celeiro de arbovírus do mundo e apresenta a maior área endêmica de febre amarela (FA). O Ministério da Saúde notificou, em 2017, 1170 casos suspeitos de febre amarela, sendo que desses 847 estão em investigação, 93 foram descartados e 230 foram confirmados, sendo nos estados de Minas Gerais (201), Espírito Santo (25) e São Paulo (4). Do total de casos notificados, 186 evoluíram para óbito, sendo que 104 óbitos permanecem em investigação, 79 óbitos foram confirmados e 3 foram descartados. A taxa de letalidade entre os casos confirmados foi de 34,3%. Para FA não há tratamento específico, no entanto, a vacinação é eficaz sendo a única e melhor maneira de prevenção. Justamente por esse fator e outros envolvidos o diagnóstico da FA não é feito no sistema de saúde a não ser por uma suspeita relevante. O problema é que em muitos casos os vírus passam despercebidos em casos de infecção pelo vírus Dengue por apresentar reatividade cruzada entre membros do gênero Flavívirus ou por apresentar sintomas inespecíficos. O presente estudo analisou 118 amostras que foram triadas para infecções suspeitas de Vírus da Dengue (VDEN) referentes ao ano de 2011 a 2013, porém descartadas para esta virose por terem dado resultados negativos para o agente viral através de testes sorológicos e moleculares no município de Goiânia, Goiás. As amostras foram encaminhadas para o Laboratório de Virologia da Universidade Federal de Goiás Regional Jataí e analisadas por métodos moleculares, como o de RT-PCR e Nested-PCR seguida da verificação do amplicon por eletroforese em gel de Agarose. Dentre as 118 amostras negativas para os vírus DENV, três das amostras foram positivas para o Vírus da Febre Amarela (VFA) conforme produção de amplicons de 253 pb da região NS5 e confirmação da identidade do amplicon por sequenciamento nucleotídico. As sequências obtidas foram submetidas ao BLAST para confirmação da identidade. A sequência traduzida foi analisada pelo software MEGA versão 7.0. Para análise filogenética foi determinado previamente o melhor modelo e em seguida a árvore foi construída com 53 sequências de todos os vírus da Febre Amarela presentes em bancos de dados para uma análise comparativa. As sequências encontradas foram comparadas com sequências do VFA registradas no banco de dados Genbank e identificouse que se refere a uma porção da proteína não estrutural NS5, posição 216 a 296 desta proteína, conferindo 81 aminoácidos. A árvore representativa demonstrou que as sequências submetidas estavam diretamente relacionadas com táxons do Senegal. A robustez do método filogenético foi por Bootstrap 2000 réplicas utilizando o melhor modelo JTT+G, Maximum Likelihood (Máxima probabilidade). O teste D de Tajima aplicado gerou um valor de D= 1.159570, demonstrando assim que não houve expansão populacional dos táxons analisados, considerando que os mesmos possuem significativo grau de conservação durante a evolução. A partir dos resultados obtidos no estudo, pode-se afirmar que já havia circulação do VFA no ano de 2013, pelo menos de pacientes atendidos na região central do Brasil, antes mesmo do último surto em 2017.