Desenvolvimento de marcadores microssatélites para Ololygon centralis (Anura: Hylidae) por sequenciamento de segunda geração com baixa cobertura

• Main Author: Castro, Andrezza Arantes
• Other Authors: Telles, Mariana Pires de Campos
• Format: Others
• Language: Portuguese
• Published: Universidade Federal de Goiás 2018
• Subjects: Anura; Microssatélite; Montagem de novo; NGS; Transposons; CIENCIAS BIOLOGICAS::GENETICA
• Online Access: http://repositorio.bc.ufg.br/tede/handle/tede/8343

Submitted by Franciele Moreira ([e-mail]) on 2018-04-16T17:42:56Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Andrezza Arantes Castro - 2018.pdf: 2625041 bytes, checksum: 5c588cc8e4644fe3bfa34ba8e1dd05a9 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) === Approved for entry into archive by Luciana Ferreira ([e-mail]) on 2018-04-17T10:54:33Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Andrezza Arantes Castro - 2018.pdf: 2625041 bytes, checksum: 5c588cc8e4644fe3bfa34ba8e1dd05a9 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) === Made available in DSpace on 2018-04-17T10:54:33Z (GMT). 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The genome draft assembled in 13989 scaffolds, which correspond to 4926069 bp with N50 = 336. The repetitive elements found in the O. centralis genome (1795 transposons, 957, microsatellite, one satellite DNA and 25 small nuclear RNAs) comprised 531337 bp. Between the retrotransposons, the LINE element (49,83%) was the most abundant, followed by LTR (48,66%) and SINE (1,56%). It was possible to identify coding genes for the 5S, 18S and 28S subunits of ribosomes. Also, 18 types of coding regions for tRNA and 26 putative genes were found in the O. centralis genome. From the microsatellite regions, it was possible to design 87 pairs of primers for the flanking sites. There were found 47 regions composed of tetranucleotides, 39 dinucleotides and on trinucleotide on the microsatellite sites. From them, 31 pairs of primers were selected for amplification and 18 showed good results. The annealing temperatures varied from 50° e 60° C. Seven markers showed polymorphism. From them, only 5 markers (PCE05, OCE11, PCE20, OCE21, OCE26) were used to characterize the genotype of 30 individuals. The medium number of alleles was 10, the allelic amplitude varied from 148 bp (OCE20) to 318 bp (OCE21). The Expected Heterozygosity was 0,7 and the observed was 0,5. The probability of parentage exclusion (Q) was 0,993 and the probability of combined identity (I) was 1,13x10-6. The global value of the fixation index (FST) was significant and equal to 0,2 (p<0.05). The data obtained from the NGS Illumina platform represent one important step for the knowledge of genomics of this species and of the anuran in general. === A facilidade para o acesso às metodologias de Sequenciamento de Segunda Geração (Next Generation Sequence) tem impulsionado o desenvolvimento de diversos projetos, uma vez que possibilita a montagem de novo de sequências, gerando uma grande quantidade de dados e permitindo o acesso a genomas de diversos organismos ainda pouco conhecidos. A espécie de anuro Ololygon centralis (Pombal e Bastos 1996) pertence à família Hylidae, considerada endêmica do Bioma Cerrado e que ainda não dispõe de nenhuma informação genômica. O objetivo desse trabalho foi realizar uma montagem parcial do genoma de Ololygon centralis a fim de identificar, caracterizar, quantificar elementos repetitivos e predizer genes nas sequências genômicas, além de desenvolver marcadores microssatélites para a espécie. O genoma parcial montado resultou em 13.989 scaffolds, que correspondem a 4.926.069 pb com N50 de 336. Os elementos repetitivos encontrados no genoma de O. centralis (1.795 elementos transponíveis, 957 microssatélites, um DNA satélite e 25 pequenos RNAs nucleares) totalizaram 531.337 pb. Entre os retrotransposons, o elemento LINE (49,83%) foi o mais abundante, seguido do LTR (48,66%) e SINE (1,56%). Foram identificados os genes que codificam as subunidades 5S, 18S e 28S de ribossomos, 18 tipos de tRNAs no genoma e 26 genes. A partir das sequências foi possível desenhar 87 pares de primers flanqueando regiões microssatélites. Dentre elas, 47 foram regiões compostas de tetranucleotídeos, 39 dinucleotídeos, e um trinucleotídeo. Deste total, 31 pares de primers foram selecionados para padronização em gel de poliacrilamida (6%) e 18 deles apresentaram produto de amplificação adequado. Durante a padronização, as temperaturas de anelamento variaram entre 50° e 60° C e sete marcadores apresentaram polimorfismo. Dos sete, apenas cinco marcadores (OCE05, OCE11, OCE20, OCE21, OCE26) foram padronizados e utilizados para caracterização em 30 indivíduos de O. centralis no analisador automático ABI3500. O número médio de alelos foi igual a 10, a amplitude alélica variou entre 148pb (OCE 20) a 318 pb (OCE 21). A Heterozigosidade média esperada foi 0,7 e a observada igual a 0,5. A probabilidade de exclusão de paternidade (Q) foi igual a 0,993 e a probabilidade combinada de identidade (I) igual a 1,13x10-6. O valor global para o índice de fixação (FST) foi significativo e igual a 0,2 (p <0,05). Os dados obtidos a partir do NGS plataforma Illumina representam um importante passo para o conhecimento genômico dessa espécie e dos anfíbios em geral, o desenvolvimento de primers contribuirá para o estudos genéticos-populacionais de Ololygon centralis e espécies correlacionadas por meio da transferibilidade.