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Previous issue date: 2013-05-02 === Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq === The thermally dimorphic fungal pathogen Paracoccidioides is the agent of
paracoccidioidomycosis. This disease is characterized by a granulomatous inflammation
with clinical forms ranging from a benign localized infection to a disseminated one. The
triazole drugs are broad-spectrum antifungal agents and are currently used to treat
infections caused by various pathogenic yeast and molds. The mechanism of action of
azoles has been elucidated in some fungi, although little is known in Paracoccidioides.
Here we aim to investigate the mechanism of action of itraconazole on Paracoccidioides
by using Representational Difference Analysis from Paracoccidioides yeast cells grown
in the absence and presence of itraconazole for 1 and 2 h. Among the Paracoccidioides
genes up-regulated by itraconazole were those mainly involved in cellular transport,
metabolism/energy, transcription, cell rescue, defense and virulence. ERG11, ERG6,
ERG3, ERG5 and ERG25 were up-regulated when evaluated in a timely manner. In vivo
infection experiment in mice corroborated in vitro results. The glyoxylate cycle and its
key enzymes isocitrate lyase and malate synthase (MLS) play a crucial role in the
pathogenicity and virulence of various fungi such as the human pathogens. Here, we
describe a study conducted to develop rational ligands as candidates to inhibit receptor
PbMLS. The important step in the search for ligands for this receptor based on structural
homology, molecular docking and molecular dynamics involving scanning virtual
(virtual screening) through the program AutoDock Vina. Identified from the database of
natural compounds (ZINC data bank) potential candidate ligands to inhibit the activity of
PbMLS when compared to the original binder. This process led us to monoterpene indole
alkaloids of the genus Palicourea (Rubiaceae) comprises about 230 species from shrubs
and small trees distributed mainly in tropical regions. From the molecular docking fifteen
compounds were tested as to its effectiveness in inhibiting the activity of PbMLS. The
specific activity of PbMLS was affected by the compounds. Four indol alkaloids showed
ability to reduce the enzyme activity. Since PbMLS is a linked surface protein that
behaves as an anchorless adhesin, and PbICL is here described as adhesin, we also
investigated if those compounds inhibit the adhesion of the protein to extracellular. Twodimensional
gel electrophoresis we used to investigate the proteins expressed
differentially during treatment with itraconazole and amphotericin B. Gels of three
independent biological replicates were digitalized and the images were analyzed using
the ImageMaster 2D Platinum 6.0 software (GE Healthcare). Spot intensities were
normalized and the statistics analyses were estimated by one-way ANOVA. The spots of
interest were excised, in-gel digested with trypsin, and the peptides were then analyzed
by MS and/or MS/MS and and sequenced. The results obtained here should assist in
understanding the mode of action of drugs in Paracoccidioides, and outline studies
identifying compounds with antifungal activity. === O fungo patógeno termodimórfico Paracoccidioides é o agente da
paracoccidioidomicose. Esta doença é caracterizada por uma inflamação granulomatosa
onde as formas clínicas vão da infecção localizada benigna a uma uma disseminada. As
drogas triazólicas são antifúngicos de amplo espectro e são usadas atualmente para tratar
infecções causadas por vários fungos patogênicos e fungos. O mecanismo de ação dos
azólicos foi elucidado em alguns fungos, embora pouco se sabe em Paracoccidioides.
Aqui, em primeiro lugar pretendemos investigar o mecanismo de ação do itraconazol em
Paracoccidioides usando análise de diferença representacional de Paracoccidioides
células de levedura crescidas na ausência e na presença de itraconazol por 1 e 2 horas.
Entre os genes Paracoccidioides up-regulados pelo itraconazol foram os envolvidos,
principalmente no transporte celular, metabolismo/energia, transcrição, defesa e
virulência. ERG11, ERG6, ERG3, ERG5 e ERG25 foram regulados quando avaliados de
forma temporal. Experimentos de infecção em camundongos corroborou resultados in
vitro. O ciclo do glioxilato e suas enzimas chave isocitrato liase (ICL) e malato sintetase
(MLS) desempenham um papel fundamental na patogenicidade e virulência de vários
fungos, assim como patogênese em humanos. Neste trabalho, descrevemos um estudo
realizado para desenvolver ligantes racionais como candidatos pra inibir o receptor
PbMLS. Apresentamos um passo importante na busca de ligantes para este receptor
baseando-se em homologia de estruturas, dinâmica molecular e acoplamento molecular
envolvendo varredura virtual (virtual screening) por meio do programa AutoDock Vina.
Identificamos a partir de banco de compostos naturais (data bank ZINC) potenciais
ligantes candidatos a inibir a atividade de PbMLS quando comparados ao ligante
original. Este processo nos conduziu aos alcalóides indólicos monoterpênicos do gênero
Palicourea (Rubiaceae) que compreende cerca de 230 espécies entre arbustos e pequenas
árvores distribuídas, principalmente, nas regiões tropicais.A partir da ancoragem
molecular quinze compostos foram testados quanto à sua eficácia na inibição da atividade
de PbMLS. A atividade específica de PbMLS foi afetado pelos compostos. Quatro
alcalóides indólico mostraram capacidade de reduzir a atividade da enzima. Desde que
PbMLS é uma proteína associada à superfície que se comporta como uma adesina
ancorada também foi investigado se os compostos inibem a adesão da proteína às
matrizes extracelulares. O processo de eletroforese em gel bidimensional foi utilizado
para investigar as proteínas diferencialmente expressas durante o tratamento com
itraconazol e anfotericina B. Gel de três réplicas biológicas independentes foram
digitalizadas e as imagens foram analisadas usando o software 6.0 Platinum 2D
ImageMaster (GE Healthcare). Intensidades dos spots foram normalizados e foram
estimadas as análises estatísticas por ANOVA one-way. Os spots de interesse foram
excisadas do gel digerida com tripsina e os péptidos foram analisados por MS e / ou MS /
MS e sequenciados. Os resultados obtidos aqui devem ajudar na compreensão do
mecanismo de ação de drogas em Paracoccidioides, e delinear estudos de identificação
de compostos com atividade antifúngica.
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