| Summary: | Made available in DSpace on 2014-07-29T15:07:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1
DISSERTACAO OSVALDO 2010.pdf: 388813 bytes, checksum: 7524bca9b65d53027197a0e944792085 (MD5)
Previous issue date: 2010-02-24 === The visceral leishmaniasis (LV) is a very important disease in public health, including zoonosis caused by members of Leishmania gender, occurring in many regions of the world. Several methods are being used to diagnose these diseases; among these methods are the Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA), indirect immunofluorescence reaction (RIFI) and direct examination by microscope. As none of these techniques allows a fast and sensitive diagnostic, methods of molecular diagnosis based on polymerase chain reaction (PCR) were developed. Recently, many groups have shown that
PCR is a sensitive and specific method to Leshmania DNA detection in a variety of samples of humans, dogs and other animals. The protocols developed until these days to the parasite diagnose by PCR, although they be effective in the
identification of the genomic DNA target, promote some inespecific amplifications or are inconclusive in the distinction of L.chagasi from other species of the gender. This work`s objective was the construction of speciesspecific iniciadores to detection of L.chagasi, and evaluation of protocols
described by other authors, aiming LV diagnosis. The primers were selected from the alignment of 18S rRNA gene sequences and also of the LSU rRNA. Were selected six new pairs of species-specific primers for L. chagasi. Besides
these new pairs were assessed seven other pairs of primers described in the literature. The results showed that the new primer pairs LCS2/LCS3 LCS1/LCS3 were efficient for the species-specific amplification of DNA fragments of L. chagasi of 259 bp and 820 bp, respectively. In the other hand
the two new PCR assays optimized in this study using the primer pairs and LCS1/LCS3 LCS2/LCS3 were effective for species-specific detection of up to 1 pg / mL of DNA from L. chagasi. The pairs of primers MC1/MC2 as well as the pair of primers PIA-94 were effective for the discrimination of species-specific L. chagasi.Other pairs of primers evaluated didn´t showed a satisfactory results regarding the specificity for L. chagasi. === A leishmaniose visceral (LV) é uma doença de grande importância em saúde pública, compreendendo zoonoses causadas por membros do gênero Leishmania, sendo de ocorrência em diversas regiões do mundo. Vários métodos já são utilizados para o diagnóstico dessas enfermidades, entre eles o ensaio imunoenzimático (ELISA), a reação de imunofluorescência indireta (RIFI) e o exame direto ao microscópio. Como nenhuma destas técnicas permite um diagnóstico sensível e rápido, métodos de diagnóstico molecular baseados na reação em cadeia pela polimerase (PCR) foram desenvolvidos. Recentemente, vários grupos têm mostrado que a PCR é um método sensível e específico para a detecção do DNA da Leishmania em uma variedade de
amostras de humanos, cães e outros animais. Os protocolos desenvolvidos até o presente para o diagnóstico deste parasito por PCR, apesar de serem eficazes na identificação do DNA genômico alvo, promovem algumas amplificações inespecíficas ou não são conclusivos na distinção de L. chagasi de outras espécies do gênero. O objetivo deste trabalho foi a construção de iniciadores espécie-específicos para a detecção de L. chagasi, assim como a avaliação de protocolos descritos por outros autores, visando o diagnóstico da LV. Os iniciadores foram selecionados a partir do alinhamento das seqüências do gene 18S rRNA e também do LSU rRNA. Foram selecionados seis novos pares de iniciadores espécie-específicos para L. chagasi. Além desses novos pares, foram avaliados outros sete pares de iniciadores descritos na literatura. Os resultados permitiram concluir que os novos pares de iniciadores LCS1/LCS3 e LCS2/LCS3 foram eficientes para a amplificação espécie específica de fragmentos de DNA de L. chagasi de 259 pb e 820 pb,
respectivamente. Já os os dois novos ensaios de PCR otimizados neste estudo, empregando os pares de iniciadores LCS1/LCS3 e LCS2/LCS3, foram efetivos para a detecção espécie-específica de até 1 pg/`L de DNA de L. chagasi. Os pares de iniciadores MC1/MC2 descritos por CORTES et al. (2004) assim como o par de iniciadores publicado por PIARROUX et al., (1994) foram efetivos para a discriminação espécie-específica de L. chagasi. Os outros pares de iniciadores avaliados não apresentaram resultados satisfatórios quanto a especificidade para L. chagasi.
|
|---|
