Caracterização do gene hisD de Mycobacterium tuberculosis H37Rv : clonagem, seqüenciamento, superexpressão e medidas de atividade enzimática do seu produto - a proteína histidinol desidrogenase

• Main Author: Ducati, Rodrigo Gay
• Other Authors: Santos, Diogenes Santiago
• Format: Others
• Language: Portuguese
• Published: 2013
• Subjects: Mycobacterium tuberculosis; Proteina; Epidemiologia; Gene
• Online Access: http://hdl.handle.net/10183/77866

Dentre todas as doenças infecciosas que têm afligido a raça humana, a tuberculose (TB) continua sendo uma das mais letais, resistindo às tentativas da história da humanidade em derrotar a consumição. Atualmente, epidemiologistas estimam que um terço da população mundial esteja infectada pelo bacilo da TB, com uma taxa anual de 8 a 10 milhões de novos casos e 3 milhões de mortes. O aumento na prevalência da TB, a emergência de cepas resistentes a múltiplas drogas, e o efeito devastador da co-infecção pelo vírus da imunodeficiência humana levaram à urgente necessidade do desenvolvimento de novas e mais eficientes drogas anti-TB. Estas podem ser desenhadas baseadas em vias metabólicas essenciais ao patógeno e ausentes em seu hospedeiro; este é o caso da via de biossíntese de histidina, que está ausente em mamíferos e é comprovadamente essencial em micobactérias. Mais especificamente, demonstrou-se experimentalmente que o nocauteamento por recombinação homóloga do gene hisD de Mycobacterium tuberculosis, codificante da enzima L-histidinol desidrogenase (HisD), gerou mutantes auxotróficos para histidina completamente inviáveis, comprovando sua essencialidade para sobrevivência. Visto que as enzimas codificantes desta via podem representar alvos atrativos para o desenvolvimento de agentes anti-TB, o gene hisD de M. tuberculosis H37Rv foi amplificado, clonado e seqüenciado, e a proteína recombinante foi superexpressa na forma solúvel em Escherichia coli BL21(DE3). Os resultados aqui apresentados validam hisD como o gene estrutural codificante da enzima HisD em M. tuberculosis, sendo um passo crucial em direção à purificação da proteína recombinante de forma a prover material para estudos estruturais e cinéticos, visando o desenho racional de novos agentes anti-TB. === Among all infectious diseases that have afflicted the human race, tuberculosis (TB) remains one of the deadliest, resisting through the historic attempts of humanity on defeating consumption. At present, epidemiologist estimate that one-third of the world population is infected by the tubercle bacilli, with an annual rate of 8 to 10 million new cases and 3 million deaths. The increasing prevalence of TB, the emergence of multidrug-resistant strains, and the devastating effect of the human immunodeficiency virus co-infection have led to an urgent need for the development of new and more efficient anti-TB drugs. They can be designed based on metabolic pathways which are essential for the pathogen and absent in its host; that is the case for the histidine biosynthetic pathway, which is absent in mammals and has been proved to be essential in mycobacteria. More precisely, experimental data has demonstrated that the disruption of Mycobacterium tuberculosis L-histidinol dehydrogenase hisD-encoding gene by homologous recombination resulted in unviable histidine auxotrophic mutants, proving its essentiality for survival. Since the coding enzymes of this pathway may represent attractive targets for the design of anti-TB agents, the hisD gene from M. tuberculosis H37Rv was amplified, cloned and sequenced, and the recombinant protein was superexpressed in the soluble form in Escherichia coli BL21(DE3). The results reported here validate hisD as the structural gene coding for histidinol dehydrogenase in M. tuberculosis, which is a crucial step towards purification of recombinant protein to provide material for structural and kinetic studies, aiming at the rational design of new anti-TB agents.