Purificação parcial e caracterização de uma protease alcalina queratinolítica de Bacillus sp. P7

• Main Author: Correa, Ana Paula Folmer
• Other Authors: Brandelli, Adriano
• Format: Others
• Language: Portuguese
• Published: 2009
• Subjects: Bacillus; Enzimas : Purificacao; Queratinase; Farinha de pena; Bacillus sp.; Keratinase; Feather meal; Purification
• Online Access: http://hdl.handle.net/10183/16334

Queratinases alcalinas apresentam um interessante potencial para utilização em processos de hidrólises de proteínas, particularmente na quebra de resíduos de queratina para obter produtos de melhor valor. Uma bactéria queratinolítica, previamente isolada do intestino de peixe Piaractus mesopotamicus da bacia Amazônica foi identificada como sendo Bacillus sp. P7. Esta linhagem foi capaz de degradar penas e farinha de penas durante cultivos submersos, com a concomitante produção de queratinases extracelulares e com o aumento da concentração de proteínas solúveis no meio. O meio de cultivo para a produção da queratinase continha farinha de pena como única fonte de carbono, nitrogênio e enxofre. A purificação da enzima envolveu as etapas de precipitação com sulfato de amônio e cromatografias de gel-filtração e de troca-iônica. Após as referidas etapas, a enzima apresentou um fator de purificação de 29,8 vezes e um rendimento de 27%. A análise do zimograma revelou 2 bandas proteolíticas. A queratinase parcialmente purificada apresentou atividade ótima em pH 9,0 e 55 °C. A atividade da enzima foi estimulada por Ca²+, Mg²+ e Sr²+, e reduzida por Hg²+, Cu²+, Zn²+ e Co²+. Os solventes ß-mercaptoetanol e Triton X-100 afetaram ligeiramente a atividade da enzima, ao passo que SDS estimulou a atividade enzimática. PMSF e ácido etilenodiaminotetracétio (EDTA) inibiram a atividade queratinolítica nos ensaios enzimáticos, sugerindo uma característica de serina protease, requerendo íons metálicos para a máxima atividade e/ou estabilidade. Tais queratinases alcalinas podem ser empregadas nas formulações de detergentes, no processamento do couro e nos processos de hidrólise protéica, especificamente na quebra de resíduos queratinosos para obter produtos de melhor valor. === Alkaline keratinases offer an interesting potential for utilization in processes of protein hydrolysis, particularly in the breakdown of keratin wastes in view to obtain added-value products. A keratinolytic bacterium was previously isolated from intestines of the Amazon basin fish Piaractus mesopotamicus and was identified as Bacillus sp. P7. This strain degraded feather meal and whole feathers during submerged cultivations, with the concomitant production of extracellular keratinolytic enzymes and the increase in soluble protein. The medium for keratinase production contained feather meal as the only source of carbon, nitrogen and sulphur. Enzyme purification was carried out by ammonium sulphate precipitation and sequential gel-filtration and ion-exchange chromatographies. The purification was about 29.8-fold, with a yield of 27%. Zymogram analysis revealed two proteolytic bands. The partially purified keratinase had optimal activity at pH 9.0 and 55 °C. Enzyme activity was stimulated by Ca²+, Mg²+ and Sr²+, and reduced by Hg²+, Cu²+, Zn²+ and Co²+. Solvents, ß-mercaptoethanol and Triton X-100 slightly affected, whereas SDS stimulated the enzyme activity. PMSF and ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) inhibited keratinase activity in enzyme assays, suggesting its major serine protease feature, requiring metallic ions for maximum activity/stability. Such alkaline keratinase might be employed in detergent formulations, in leather processing, and in processes of protein hydrolysis, specifically the breakdown of keratin wastes to obtain value-added products.