A influência dos íons cálcio e magnésio na toxicidade do cádmio e o envolvimento da proteína Pmr1 no uso da via secretora para desintoxicação de cádmio em Saccharomyces cerevisiae

• Main Author: Lauer Júnior, Cláudio Marcos
• Other Authors: Henriques, Joao Antonio Pegas
• Format: Others
• Language: Portuguese
• Published: 2008
• Subjects: Cádmio; Saccharomyces cerevisiae; Toxicidade
• Online Access: http://hdl.handle.net/10183/12043

O cádmio é um metal pesado com propriedades tóxicas e carcinogênicas. A toxicidade deste metal pode ser resultado da sua habilidade de (i) formar complexos com a glutationa, gerando aumento do estresse oxidativo, (ii) competir com o zinco por sítios de ligação em proteínas, (iii) causar quebras de fita simples no DNA e (iv) inibir a via associada ao reparo de erros no emparelhamento de bases do DNA. A absorção de cádmio para o interior celular pode ser feita por proteínas que transportam metais essenciais como zinco, cálcio, manganês e ferro, tal como a proteína Zrt1 de leveduras (transportador de alta afinidade para zinco). Em Saccharomyces cerevisiae, o mecanismo de desintoxicação de cádmio mais conhecido envolve a conjugação do metal com glutationa, formandos complexos Cd.[GS]2, que são transportados para o interior do vacúolo pela proteína Ycf1. Além disso, sabe-se que alguns poucos metais essenciais são capazes de reduzir a toxicidade do cádmio. O objetivo do presente estudo foi verificar o efeito protetor de íons de magnésio e cálcio contra os danos causados pelo cádmio em linhagens de S. cerevisiae mutantes para proteínas envolvidas com a homeostase de cádmio (gsh1 , ycf1 e zrt1 ). Além disso, foi avaliado o envolvimento de proteínas transportadoras de cálcio presentes no complexo de Golgi e vacúolo (Pmr1p e Pmc1p, respectivamente) com a desintoxicação de cádmio por vesículas da via secretória de S. cerevisiae. Os resultados demonstram que, tanto na linhagem selvagem quanto nas mutantes gsh1 , ycf1 e zrt , a presença de íons de cálcio ou magnésio é capaz de proteger as células contra os efeitos tóxicos do cádmio. Essa proteção está associada a uma redução do conteúdo intracelular de cádmio que ocorre nos tratamentos simultâneos com magnésio e cálcio. Em relação aos transportadores de cálcio, foi possível observar que a linhagem pmc1 não é sensível à cádmio enquanto que a linhagem pmr1 é altamente sensível a presença do metal. Para confirmar o envolvimento da proteína Pmr1 com a desintoxicação de cádmio, a linhagem pmr1. foi submetida a um ensaio de complementação fenotípica utilizando-se um vetor centromérico contendo o gene PMR1. Os resultados deste ensaio confirmaram que o fenótipo de sensibilidade a cádmio da linhagem pmr1. pode ser revertido pela presença de uma cópia funcional do gene PMR1. Adicionalmente, os resultados utilizando PIXE (Particle Induced X- Ray Emission) para quantificar o conteúdo intracelular de cádmio mostraram que na pmr1. o acúmulo intracelular de íons Cd2+ é três vezes maior doque na linhagem selvagem e na linhagem pmr1. contendo o vetor com o gene PMR1 funcional. A proteína Pmr1 é responsável pelo acúmulo de cálcio em vesículas do complexo de Golgi, as quais podem ser destinadas para a via secretória de S. cerevisae. Considerando os resultados obtidos neste trabalho e a similaridade entre os íons Ca2+ e Cd2+ em termos de raio atômico, é possível inferir que o cádmio, assim como o cálcio, pode ser bombeado para o interior do Golgi pela Pmr1p e posteriormente transportado pela via secretória. Sendo assim, este trabalho descreve desintoxicação de cádmio envolvendo a eliminação do metal pela via secretória de S. cerevisiae. === Cadmium is a heavy metal with toxic and carcinogenic properties. The toxicity of this metal depends on its ability to: (I) produce complexes with glutathione, therefore increasing oxidative stress, (II) compete with zinc for binding to proteins, (III) cause DNA chain single breaks, and (IV) inhibit the mismatch repair pathway associated. Cadmium uptake into the cell occurs through proteins that transport essential metals, such as calcium, zinc, manganese, and iron, such as the yeast Zrt1 protein transporter with high zinc affinity. In Saccharomyces cerevisiae, the best known cadmium detoxification mechanism involves metal coupling with glutathione, forming the complex Cd[GS]2, which is carried inside to the vacuole through the Ycf1 protein. Moreover, it is well known that some essential metals are capable of reducing cadmium toxicity. The aim of the present study was to verify the protective effect of magnesium and calcium ions against the damages caused by cadmium in S. cerevisiae strains mutant for proteins involved with cadmium homeostasis (gsh1 , ycf1 e zrt1 ). In addition, the involvement of a calcium transporter present in the Golgi apparatus and in the vacuole (Pmr1p and Pmc1p, respectively) with the detoxification of cadmium by vesicles of the secretory pathway of S. cerevisiae was evaluated.The results demonstrated that both in the wild type strain and in gsh1 , ycf1 , and zrt mutant strains, the presence of calcium or magnesium ions was able to protect cells against the toxic effect of cadmium. This protection was associated with a reduction of intracellular cadmium content that occurs in the simultaneous treatments with magnesium and calcium As to calcium transporters, it was possible to observe that pmc1. is not sensitive to cadmium, whereas pmr1. is highly sensitive to the presence of this metal. In order to confirm the involvement of Pmr1p with cadmium detoxification, pmr1. strains were submitted to a phenotypic complementation assay using centromeric vector containing PMR1 gene. The results of this assay confirmed that pmr1. cadmium sensitive phenotype can be reversed by the presence of a functional copy of PMR1 gene. Additionally, when using PIXE (Particle Induced X Ray Emission) to quantify intracellular cadmium content, results showed that pmr1. intracellular accumulation of Cd2+ ions is three times higher than in the wild type strain, and the pmr1. containing the vector with PMR1 functional gene.Pmr1 protein is responsible for the accumulation of calcium in vesicles of Golgi apparatus, which can be directed to the secretory pathway of S. cerevisae. Considering the results obtained in this study, and the similarity between Ca2+ and Cd2+ ions in terms of atomic radius, it is possible to infer that both cadmium and calcium can be pumped inside the Golgi apparatus by Pmr1p, and later transported by the secretory pathway. Therefore, this work describes cadmium detoxification involving the elimination of this metal by the secretory pathway of S. cerevisiae.