| Summary: | Submitted by Fabíola Silva (fabiola.silva@famerp.br) on 2018-02-15T14:23:39Z
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Previous issue date: 2016-11-04 === Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo - FAPESP === Introduction: Hypoxia is a known adverse factor to cancer treatment, able to activate the signaling pathways PI3K and AMPK/Akt/mTOR, the two major pathways involved in the angiogenesis process. This process is regulated by many factors, being the most important factors the Hypoxia-Inducible Factor-1α (HIF-1α) and Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF). Metformin has demonstrated its ability to reduce the incidence of cancer in diabetic patients with positive results especially in breast cancer, inhibiting cell growth by AMPK/Akt/mTOR signaling pathway. Likewise, LY294002 is the major inhibitor of PI3K/AKT/mTOR signaling pathway that has anti-angiogenic properties, capable to reduce the release of growth factors such as VEGF. The treatment with metformin in addition to the inhibitor LY294002 in both normal oxygen and hypoxia conditions, as well as the action in the process of angiogenesis in canine mammary tumors is unprecedented. Objectives: To evaluate the influence of metformin and LY294002 inhibitor treatment in tumor angiogenesis as a therapeutic strategy in mammary tumors in a in vitro and in vivo study. Material and Methods: In the in vitro study, we analyzed the cell viability of canine mammary tumor cell lines CMT-U229 (benign mixed tumor) and CF41 (metastatic carcinoma) before and after treatment with metformin and/or LY294002 by MTT assay. The cell cycle distribution was analyzed by flow cytometry flow, protein and gene expression of VEGF and HIF-1α by immunohistochemistry and RT-PCR, respectively. All experiments were performed in normal oxygen conditions and under hypoxia by the addition of cobalt chloride (CoCl2). For the in vivo study, CF41 cells were implanted in 20 female mice BALB / c nude nude. After 28 days of treatment with metformin and LY294002, it was analyzed micro vessel density by CD31 expression by immunohistochemistry as well as gene and protein expression of HIF-1α and VEGF in the tumor tissue. Results: The treatment with metformin and LY294002 was able to reduce the cellular viability after 24 hours. The protein and gene expression of HIF-1α and VEGF decreased after treatment with metformin and LY294002, both in normal oxygen conditions and hypoxia. In the in vivo study, there was a decrease in tumor size, protein and gene expression of HIF-1α and VEGFA, in addition to the decreasing of CD31 expression after all treatments. Conclusions: Our results demonstrated the effective action of metformin and LY294002 inhibitor in controlling the angiogenesis process in mammary tumors by the angiogenic factors VEGF and HIF-1α. === Introdução: A hipóxia é um conhecido fator adverso ao tratamento do câncer, capaz de ativar as vias de sinalização PI3K e MAPK/Akt/mTOR, as duas principais vias envolvidas no processo de angiogênese. Esse processo é regulado por inúmeros fatores, sendo os mais importantes o Fator Induzido por Hipóxia-1α (HIF-1α) e o Fator de Crescimento Endotelial Vascular (VEGF). A metformina tem demonstrado sua capacidade de diminuir a incidência de neoplasias em pacientes diabéticos com resultados positivos especialmente no câncer de mama, inibindo o crescimento celular através da via de sinalização MAPK/Akt/mTOR. Da mesma forma, o LY294002 é um importante inibidor da via de sinalização PI3K/AKT/mTOR que possui propriedades anti-angiogênicas, capaz de diminuir a liberação de fatores de crescimento como o VEGF. A combinação do tratamento com metformina e com o inibidor LY294002 tanto em condições normais de oxigênio quanto em hipóxia, bem como a ação no processo de angiogênese em tumores mamários caninos é inédita. Objetivos: Avaliar a influência do tratamento com metformina e com o inibidor LY294002 na angiogênese tumoral como estratégia terapêutica nas neoplasias mamárias, em um estudo in vitro e in vivo. Material e Métodos: No estudo in vitro, foi analisada a viabilidade das células das linhagens tumorais mamárias caninas CMT-U229 (tumor misto benigno) e CF41 (carcinoma metastático) antes e após o tratamento com metformina e/ou LY294002 por ensaio MTT. A distribuição das células nas fases do ciclo celular foi avaliada por citometria de fluxo, a expressão proteica e gênica do VEGF e do HIF-1α por imuno-histoquímica e PCR em Tempo Real, respectivamente. Todos os experimentos foram realizados em condições normais de oxigênio e sob hipóxia pela adição de cloreto de cobalto (CoCl2). Para o estudo in vivo, células da linhagem tumoral mamária canina CF41 foram implantadas em 20 camundongos fêmeas Balb/c nude atímicos. Após 28 dias de tratamento com metformina e LY294002, foi analisada a microdensidade vascular pela expressão do CD31 por imunohistoquímica, bem como a expressão proteica e gênica do VEGF e HIF-1α no tecido tumoral. Resultados: O tratamento com metformina e com LY294002 foi capaz de diminuir significativamente a viabilidade celular, após 24 horas. A expressão proteica e gênica do HIF-1α e do VEGF diminuiu após o tratamento com metformina e LY294002 tanto em hipóxia quanto em condições normais de oxigênio. No estudo in vivo, houve diminuição do tamanho tumoral e da expressão proteica e gênica do VEGFA e HIF-1α, além da diminuição da expressão do CD31, após os tratamentos. Conclusões: Nossos resultados demonstram a efetiva ação da metformina e do inibidor LY294002 no controle do processo de angiogênese em câncer de mama, por meio dos marcadores angiogênicos VEGF e HIF-1α.
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