Obtenção de primers microssatélite e desenvolvimento, validação e mapeamento de marcadores SCAR em feijoeiro-comum

• Main Author: Queiroz, Vagner Tebaldi de
• Other Authors: Barros, Everaldo Gonçalves de
• Language: Portuguese
• Published: Universidade Federal de Viçosa 2016
• Subjects: Feijão - Melhoramento genético; Marcadores genéticos; Mapeamento cromossômico; Locos de caracteres quantitativos; Polimorfismo do DNA ampliado ao acaso; Ciências Biológicas
• Online Access: http://www.locus.ufv.br/handle/123456789/8784

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas ([e-mail]) on 2016-10-05T19:00:00Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1608244 bytes, checksum: 73ced9bf50274d34a09508edd0498859 (MD5) === Made available in DSpace on 2016-10-05T19:00:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1608244 bytes, checksum: 73ced9bf50274d34a09508edd0498859 (MD5) Previous issue date: 2004-09-20 === Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico === Embora apresente várias limitações, a técnica de RAPD ainda representa a principal ferramenta utilizada no Programa de Melhoramento Genético do Feijoeiro- comum BIOAGRO/UFV. Para contornar os problemas apresentados por esta técnica, a estratégia utilizada por vários pesquisadores tem sido a conversão dos marcadores RAPD em marcadores SCAR e o desenvolvimento de primers microssatélite. Assim, no presente trabalho foram desenvolvidos 5 primers SCAR para mancha-angular, 5 primers para ferrugem e 7 primers para antracnose. Os primers desenvolvidos para mancha-angular derivaram-se dos marcadores OPM02 425 , OPBA16 669 , OPH13 490 e OPH14+AA19 400 e foram mapeados, em acoplamento, a 5,3, 7,1, 5,6 e 10,1 cM, dos respectivos genes de resistência. Os primers desenvolvidos para ferrugem originaram-se dos marcadores OPAE19 890 , OPX11 550 , OPAJ18+AH10 700 , mas apenas o primer sAE19 foi validado. Este foi mapeado, em repulsão, a 1,0 cM do gene de resistência Ur-11. Os primers para antracnose foram desenvolvidos, a partir da seqüência dos fragmentos OPAZ20 940 , OPY20 830 , OPC08 900 , OPZ04 560 , OPB03 1800 , OPZ09 950 , OPH18 830 . Destes, apenas os primers sAZ20, sY20, sC08, sZ04 foram mapeados, em acoplamento, a 7,1, 1,2, 7,8 e 2,9 cM, dos respectivos genes de resistência. Os primers microssatélite foram desenvolvidos, a partir das seqüências de fragmentos de DNA genômico de 3 pequenas bibliotecas enriquecidas. As bibliotecas enriquecidas para as repetições GGC, CCA e AT permitiram a seleção de 79, 172 e 50 clones positivos, respectivamente. Do total de 301 clones que foram identificados, 153 já foram seqüenciados. Observou-se que 40 (26%) clones seqüenciados apresentaram fragmentos de DNA contendo microssatélite, os quais variaram quanto ao tipo, número e tamanho. As seqüências apresentaram repetições de di-, tri-, tetra- e até pentanucleotídeos. Em um mesmo fragmento, foram encontrados até 3 microssatélites. Entre as seqüências analisadas, foram observadas repetições perfeitas, imperfeitas e compostas, variarando entre 12 e 24 pb. Até o momento, foram desenhados e testados 10 pares de primers, sendo um deles originado da seqüência do marcador RAPD OPAZ20 940 . Destes, apenas 5 pares (FCctc001, FCggc001, FCccg001, FCccg002 e FCgca001) amplificaram fragmentos com tamanho esperado e bem definidos. Entretanto, esses primers foram monofórficos, quando testados entre diferentes cultivares andinos e mesoamericanos. Os primers SCAR, desenvolvidos e validados no presente trabalho, foram testados juntamente com 45 pares de primers microssatélite comerciais, entre os genitores de uma população de 154 RIL ́s. Dos primers selecionados, 7 foram mapeados em 10 grupos de um mapa parcial de ligação já existente e 1 permaneceu não-ligado. O mapa de ligação sofreu pequena variação no tamanho (247,8/252 cM) e no número de grupos de ligação (9/10 grupos). Entretanto, pela análise de variância foram constatadas associações significativas desses marcadores com diferentes características quantitativas. As associações mais significativas foram constatadas por meio de análises de regressão stepwise, as quais promoveram alteração no valor de R 2 da regressão múltipla para algumas das características. As características MAT (número de dias até a maturação), VAPLA (número médio de vagens por planta), SEPLA (número médio de sementes por planta) e PRVAG (produção média por vagem), que apresentavam valores de R 2 de 40,14; 28,99; 14,03 e 17,13 , tiveram um aumento para 44,30; 34,53; 21,92 e 26,03, respectivamente. A inclusão do marcador sH13 no GL 07 possibilitou a identificação de um novo QTL para a característica VAPLA. Este marcador também mostrou-se associado ao QTL, anteriormente, descrito para SEPLA. O marcador BM165 foi mapeado no GL 02 e mostrou-se associado a 4 QTLs diferentes, identificados para as características MAT, P100 (peso de 100 sementes), SEPLA e PRVAG. === The RAPD technique represents the major molecular tool for assisting the common bean breeding program of the BIOAGRO/UFV, in spite of its limitations. The conversion of the RAPD markers into SCAR ones, as well as the development of SSR primers are the strategy adopted by several researchers in order to relieve these problems. Therefore, 5 primers SCAR to angular leaf spot, 5 primers to rust and 7 primers to anthracnose were developed. The primers developed to angular leaf spot were derived from the RAPD markers OPM02 425 , OPBA16 669 , OPH13 490 and OPH14+AA19 400 and were mapped, in coupling phase, at 5.3, 7.1, 5.6 and 10.1 cM, from their respective resistance genes. The primers developed to rust were originated from the RAPD markers OPAE19 890 , OPX11 550 , OPAJ18+AH10 700 , although only the primer sAE19 was validated. It was mapped, in repulsion, at 1.0 cM distance from the resistance gene Ur-11. The primers developed for anthracnose were obtained from the fragment sequences of OPAZ20 940 , OPY20 830 , OPC08 900 , OPZ04 560 , OPB03 1800 , OPZ09 950 , OPH18 830 , from wich, only the primers sAZ20, sY20, sC08, sZ04 were validated. They were mapped, in coupling phase, at 7.1, 1.2, 7.8 and 2.9 cM, from their respective resistance genes. The SSR primers were developed from the sequences of the genomic DNA fragments obtained from three small enriched libraries. The libraries were enriched for the repetitions GGC, CCA and AT and made possible the selection of 79, 172 e 50 positive clones, respectively. From the total of 301 positive and identified clones, 153 were sequenced. From these clones, 40 (26%) presented DNA fragments containing microsatellite that showed variations for type, number, and size. The sequences showed repetitions of two, three, four, and five nucleotides. In the same DNA fragment, a total up to three microsatellites were found. Among the analyzed sequences, some perfect, imperfect, and compound repetitions ranging from 12 to 24 bp were found. Until this moment, only 10 pairs of primers were designed and tested; one of them was originated from the RAPD marker OPAZ20 940 . From those, only 5 pairs (FCctc001, FCggc001, FCccg001, FCccg002 e FCgca001) amplified the well-defined fragments with the expected size. However, those primers were monomorphics ones, when tested among different andean and mesoamerican cultivars. The developed and validated SCAR primers were tested together with 45 pairs of commercial SSR primers between the genitors of 154 RIL populations. From the selected primers, 7 were mapped into 10 groups of a partial linkage map already available in the lab, whereas one stayed discoupled. The linkage map was slightly altered in its size (247.8/252 cM) and number of linkage groups (9/10 groups). Variance analysis detected siginificative associations of these markers with different quantitative traits. The most significative associations were detected by stepwise regression analysis that promoted alteration in R 2 values of the multiple regression analysis for some traits. The R 2 values of the traits MAT (the number of days until the bean maturation), VAPLA (the average pod number per plant), SEPLA (the average seed number per plant) and PRVAG (the average yield per pod) increased from 40.14, 28.99, 14.03 and 17.13 to 44.30, 34.53, 21.92 and 26.03, respectively. The marker sH13 included into LG 07 allowed for the identification of a new QTL for the trait VAPLA. This marker also showed to be associated with the QTL previously described for SEPLA. The marker BM165 was mapped in LG 02 and showed to be associated with four different QTLs identified for the traits MAT, P100 (100-seed weight), SEPLA and PRVAG. === Tese importada do Alexandria