Expressão e substituição alélica dos genes de dessaturases de ácidos graxos em soja

• Main Author: Pinto, Marcos de Oliveira
• Other Authors: Moreira, Maurílio Alves
• Language: Portuguese
• Published: Universidade Federal de Viçosa 2016
• Subjects: Glycine max; Genética vegetal; Ácidos graxos Ômega-3 - Síntese; Ácidos graxos Ômega-6 - Síntese; Plantas - Efeito da temperatura; Regulação de expressão gênica; Genética Vegetal
• Online Access: http://www.locus.ufv.br/handle/123456789/7893

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas ([e-mail]) on 2016-06-14T16:15:19Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 3336095 bytes, checksum: 95e091fc2de36640318c4cb1a88e5114 (MD5) === Made available in DSpace on 2016-06-14T16:15:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 3336095 bytes, checksum: 95e091fc2de36640318c4cb1a88e5114 (MD5) Previous issue date: 2012-08-24 === Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior === A utilização de métodos de melhoramento genético pode levar à obtenção de genótipos de soja com características de interesse econômico e composição ideal de ácidos graxos na fração óleo. Para isso, é necessário o maior entendimento dos mecanismos que levam à alteração do conteúdo de ácidos graxos frente a diferentes condições de cultivo e a avaliação das substituições dos alelos dos genes que controlam essas características. Neste contexto, o objetivo desse trabalho foi avaliar o efeito da temperatura no conteúdo de óleo, composição de ácidos graxos e expressão gênica das ω-6 e ω-3 dessaturases em genótipos contrastantes para o conteúdo de ácido oléico e linolênico e avaliar o efeito da substituição alélica das ω-3-dessaturases de ácidos graxos insaturados em soja, com base em marcadores SNPs. Para os experimentos do efeito da temperatura na via de biossíntese de ácidos graxos, foram utilizados os genótipos: CD219, variedade comercial com concentrações normais de ácido oléico (~19%) e ácido linolênico (~8%); A29, com baixa concentração de ácido linolênico (~1%) e FA22, com elevada concentração de ácido oléico (~50%). O experimento foi conduzido em duas casas de vegetação: i) com aquecimento, que permitiu a obtenção de temperaturas médias (máxima e mínima) de 32/27°C; ii) sem aquecimento, que permitiu a obtenção de temperaturas médias de 26/14°C. As sementes em desenvolvimento foram subdivididas em dez estádios de acordo com o seu peso úmido, tendo o valor de incremento entre estádios de 50 mg. O conteúdo de óleo foi determinado no extrator soxhlet e composição de ácidos graxos por cromatografia gasosa. Os possíveis genes das dessaturases foram identificados no banco de dados Phytozome e a partir dessas sequências foram desenhados primers para experimentos de expressão gênica nas sementes dos 5° e 8° estádios de desenvolvimento. Não foi observado efeito significativo da temperatura de cultivo no teor de óleo bruto em sementes maduras dos genótipos CD219, A29 e FA22. Os perfis do acúmulo de ácidos graxos insaturados durante a ontogenia das sementes variaram em função do genótipo. FA22 apresentou maior conteúdo de ácido oléico e menor conteúdo de ácido linolênico em sementes cultivadas em alta temperatura em todos os estádios de desenvolvimento. Enquanto que em CD219 esse efeito foi observado apenas nos estádios finais. Quinze genes foram identificados como potenciais constituintes da família das dessaturases: 8 referentes às ω-6-dessaturases e 7 referentes às ω-3-dessaturases. Dentre os genes das ω-6- dessaturases Glyma10g42470 e Glyma20g24530 apresentaram maior expressão relativa em sementes de soja em desenvolvimento. Dentre os genes das ω-3-dessaturases genes Glyma02g39230; Glyma14g37350 e Glyma18g06950 apresentaram os maiores valores de expressão relativa em sementes de soja em desenvolvimento. Contrariamente ao esperado, os genes das ω-6-dessaturases Glyma10g42470, Glyma15g23200 e Glyma20g24530 apresentaram maior acúmulo de transcritos na maior temperatura (32/27°C) de cultivo. O gene da ω-3-dessaturases Glyma18g06950 apresentou perfil de expressão compatível com as alterações no conteúdo de ácido linoléico/linolênico nos genótipos FA22 e CD219 em função da temperatura em sementes em desenvolvimento. Para o experimento de avaliação do efeito da substituição alélica das ω-3-dessaturases de ácidos graxos insaturados em soja com base em marcadores SNPs, foram genotipadas 185 progênies F2 derivadas do cruzamento entre A29 (mutante para três genes FAD3, 1% de 18:3∆3,6,9) e Tucunaré (genótipo normal, 11% de 18:3∆3,6,9). Os resultados demonstram que os marcadores moleculares para os genes FAD3A, FAD3B e FAD3C foram eficientes no monitoramento do conteúdo de ácido linolênico nas populações segregantes F2 e F2:3. Além disso, as substituições dos alelos no loco FAD3A proporcionam maiores variações no conteúdo de ácido linolênico que as substituições nos outros dois locos. A partir desses dados, espera-se que seja possível introduzir os alelos recessivos dos genes FAD3A, FAD3B e FAD3C da linhagem A29 em genótipos elites do Programa de Melhoramento da Qualidade da Soja (PMQS) do BIOAGRO/UFV e desenvolver linhagens de soja especiais para a agroindústria apresentando baixos teores do ácido linolênico. === The use of genetic breeding may lead to the development of soybean genotypes with traits of economic interest and improved composition of fatty acids in the oil fraction. To achieve this goal, a better understanding of the mechanisms that lead to changes in fatty acid contents under different growing conditions and evaluation of allelic substitutions of genes that control these traits are needed. In this context, the aim of this study was to evaluate the effect of temperature on oil content, fatty acid composition and gene expression of ω-6 and ω-3 desaturases in genotypes contrasting for oleic and linolenic acid contents. In addition, the effect of allelic substitutions of fatty acid ω-3-desaturases genes was also evaluated. For the experiments on the effect of temperature on fatty acid biosynthesis the following genotypes were used: CD219, commercial variety with normal concentrations of oleic acid (~ 19%) and linolenic acid (~ 8%); A29, with low concentration of linolenic acid (~ 1%) and FA22, with a high concentration of oleic acid (~ 50%). The experiment was conducted in two greenhouses: one with heating, with average temperatures (maximum and minimum) of 32/27 °C, and the other with no heating, with average temperatures of 26/14 °C. The developing seeds were divided into ten stages according to the fresh weight, and the increment value between stages of 50 mg. The oil content was determined by soxhlet extractor and the fatty acid composition by gas chromatography. Possible desaturase genes were identified in the Phytozome database and from these sequences primers were designed for gene expression experiments. There was no significant effect of temperature on oil content in mature seeds of genotypes CD219, A29 and FA22. The accumulation profiles of the unsaturated fatty acids during seed ontogeny varied according the genotype. FA22 showed higher oleic and low linolenic acid contents in plants grown under high temperature at all stages of development. While in CD219 this effect was observed only in the later stages. Fifteen genes were identified as potential components of the desaturase family: 8 for ω-6-desaturases and 7 for ω-3 desaturases. Among the ω-6- desaturase genes, Glyma10g42470 and Glyma20g24530 showed higher relative expression in developing soybean seeds. Among the genes of ω-3-desaturase genes, Glyma02g39230, Glyma14g37350 and Glyma18g06950 showed higher relative expression during seed development. Contrary to expectation, ω-6-desaturases genes Glyma10g42470, Glyma15g23200 and Glyma20g24530 showed higher accumulation of transcripts under higher temperatures (32/27 °C). The ω-3-desaturase gene Glyma18g06950 showed expression profile compatible with the changes in the linoleic/ linolenic acid contents of genotypes FA22 and CD219 as a function of temperature during seed development. To evaluate the effect of allelic substitution of ω-3 desaturases genes SNP markers were genotyped in 185 F2 and F2:3 progenies derived from a cross between A29 (mutant for the three FAD3 genes, 1% 18:3∆3,6,9) and Tucunaré (normal genotype, 11% 18:3∆3,6,9). The results demonstrate that the molecular markers for genes FAD3A, FAD3B and FAD3C were efficient in monitoring the linolenic acid content in segregating populations F2 and F2:3. In addition, substitutions at the FAD3A locus provided greater variations in the linolenic acid content than substitutions in the other two loci. From these data, it is expected that it is possible to introduce the recessive alleles of genes FAD3A, FAD3B and FAD3C of A29 in elite genotypes of the Breeding Program for Soybean Quality of BIOAGRO/UFV and to develop special soybean lines for the agroindustry with low linolenic acid content.