Caracterização molecular de dois fatores de transcrição WRKY expressos na interação tomateiro - Alternaria solani

• Main Author: Rocha, Cynthia de Melo
• Other Authors: Mizubuti, Eduardo Seiti Gomide
• Language: Portuguese
• Published: Universidade Federal de Viçosa 2016
• Subjects: Tomateiro; Fatores de transcrição; Fitopatologia
• Online Access: http://www.locus.ufv.br/handle/123456789/7892

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas ([e-mail]) on 2016-06-14T15:37:09Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1034565 bytes, checksum: c504a98dadccf295255bca92bfe49d24 (MD5) === Made available in DSpace on 2016-06-14T15:37:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1034565 bytes, checksum: c504a98dadccf295255bca92bfe49d24 (MD5) Previous issue date: 2005-04-28 === Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico === Os genes WRKY codificam proteínas de ligação ao DNA que reconhecem a seqüência conservada de nucleotídeos (T)(T)TGAC(C/T) (W box), presente em promotores de genes de defesa relatados em plantas. As proteínas WRKY podem ser divididas em grupos e subgrupos distintos, com base nas características do domínio WRKY de ligação ao DNA altamente conservado entre os membros dessa família e de pequenos domínios adicionais conservados. Esse trabalho objetivou caracterizar, mediante a obtenção da seqüência completa, dois fatores de transcrição WRKY relacionados aos clones de cDNA MG.LE.EB.A3.0208D3 e MG.LE.EB.A3.0209E3 que foram expressos na linhagem resistente NC-EBR-2 de tomateiro (Lycopersicon esculentum Mill.) 36 horas após a inoculação com o fungo Alternaria solani. A triagem efetuada por PCR de uma biblioteca de fosmídeos da linhagem NC- EBR-2, utilizando-se oligonucleotídeos derivados das seqüências dos clones MG.LE.EB.A3.0208D3 e MG.LE.EB.A3.0209E3, resultou na identificação de um clone fosmídeo correspondente a cada clone. Por meio do seqüenciamento shotgun desses clones, foram obtidas duas ORFs (open reading frame, sequência aberta de leitura) denominadas de LeWRKY1 (fator de transcrição WRKY 1 de L. esculentum) com 1.165pb e LeWRKY2 (fator de transcrição WRKY 2 de L. esculentum) com 1.570pb, correspondente aos clones MG.LE.EB.A3.0208D3 e MG.LE.EB.A3.0209E3, respectivamente. A proteína codificada por LeWRKY1, que apresenta similaridade de seqüência com a proteína NtWRKY3 de Nicotiana tabacum, possui em sua seqüência de 328 aminoácidos um domínio WRKY de ligação ao DNA, um motivo dedo de zinco do tipo Cys 2 His 2, um motivo conservado denominado domínio 1 que constitui um sinal de localização nuclear e um domínio conservado que inclui a região C de ligação a calmodulina. Essas características permitem classificar LeWRKY1 no grupo II, subgrupo d, dos fatores de transcrição WRKY. Esta proteína apresenta também um domínio N-terminal de 41 aminoácidos com função ainda desconhecida. Na região promotora de LeWRKY1 foi observada a presença do elemento promotor TATA box a –55pb e duas regiões W box a – 89pb (WA) e a –76pb (WB) do sítio de início da transcrição. Análise de Southern blot revelou que esse gene está presente em mais de uma cópia no genoma do tomateiro. A proteína codificada pelo gene LeWRKY2 apresentou similaridade de seqüência com a proteína tWRKY4 de Nicotiana tabacum e possui uma seqüência de 291 aminoácidos constituída de um domínio WRKY de ligação ao DNA e um motivo dedo de zinco Cys 2 HisCys, sendo classificada como membro do grupo III dos fatores de transcrição WRKY. A análise por meio de Southern blot indicou que o gene LeWRKY2 está presente em única cópia no genoma do tomateiro. A comprovação e a quantificação da contribuição desses genes na resistência do tomateiro a Alternaria solani depende, entretanto, de estudos de expressão e análise funcional. === The WRKY genes codify to DNA binding proteins that recognize the conserved nucleotide sequences (T)(T)TGAC(C/T) (W box) present in promoters of plant defense genes. The WRKY proteins can be divided in distinct groups and subgroups, based on characteristics of the DNA binding WRKY domain and on additional conserved small domains. This work aimed to characterize, by means of sequencing, two WRKY transcription factors related to cDNA clones MG.LE.EB.A3.0208D3 and MG.LE.EB.A3.0209E3 expressed in the resistant tomato lineage NC-EBR-2 36 hours post inoculation with the fungus Alternaria solani. Genomic DNA fragments that contained the genes correspondent to each cDNA clones were identified by PCR screening of NC-EBR-2 fosmid genomic library making use of primers derived from MG.LE.EB.A3.0208D3 and MG.LE.EB.A3.0209E3 sequences. Two ORFs (open reading frame) were obtained by sequencing clones from the shotgun library of these fosmids. They were designated as LeWRKY1 (L. esculentum WRKY transcription factor 1, correspondent to MG.LE.EB.A3.0208D3) and LeWRKY2 (L. esculentum WRKY transcription factor 2, correspondent to MG.LE.EB.A3.0209E3), having 1.165bp and 1.570bp, respectively. The protein codified by LeWRKY1 that is similar to the protein NtWRKY3 of Nicotiana tabacum and has 328 amino acids with one WRKY DNA binding domain, one Cys 2 His 2 zinc finger motif, one conserved nuclear localization signal, and one conserved domain that included the calmodulin binding region C. These characteristics classify LeWRKY1 into group II, subgroup d of WRKY transcription factors. This protein also presents an N-terminal domain that comprises 41 amino acids of unknown function. One TATA box element at –55 bp and two W box regions at –89 bp (WA) and –76 bp (WB) at the transcription start position were observed in promoter region of LeWRKY1. Southern blot analysis indicated that more than one copy of this gene is present in the tomato genome. The protein codified by LeWRKY2 presented sequence similarity to tWRKY4 protein of N. tabacum and has 291 amino acids sequence that consists of WRKY DNA binding protein domain and one Cys 2 HisCys zinc finger motif, being classified as group III member of WRKY transcription factors. Southern blot analysis indicated that of LeWRKY2 is a single copy gene. === Dissertação antiga