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Previous issue date: 2010-01-27 === Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico === Peptídeos antimicrobianos (AMPs) são expressos por muitos organismos e apresentam uma função multifacetada. Estudos os têm revelado como potenciais agentes antibacterianos, defensivos agrícolas, medicamentos cicatrizantes, imuno-moduladores, agentes quimiotáticos, entre outros. Defensinas, a maior família dos peptídeos antimicrobianos, são moléculas com prevalência catiônica, ricas em cisteínas, apresentando em geral três ou quatro pontes dissulfídicas. São constituídas de 45 a 54 resíduos de aminoácidos, encontradas em organismos vertebrados e invertebrados, apresentam atividade contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, fungos e vírus encapsulados. Essas moléculas apresentam baixa toxicidade a animais e plantas, justificando assim seu uso como drogas ou defensivos agrícolas. As defensinas atuam por meio de atrações eletrostáticas com a face externa das membranas celulares alvo, gerando poros e ocasionando morte celular. Elas também atuam, segundo estudos recentes, como sinalizadores primários e secundários em vias apoptóticas e como agentes potencializadores das defesas imunológicas, sendo o mecanismo de atuação molecular ainda desconhecido. A busca por AMPs de plantas tem sido realizada no Laboratório de Proteômica e Bioquímica de Proteínas (DBB/UFV) visando à caracterização estrutural desses peptídeos. O isolamento de peptídeos antimicrobianos de extratos solúvel (ES) e de parede celular (EP) de folhas de pimentão da variedade Sunshine foi realizado por etapas pré-cromatográficas (centrifugações, fracionamento salino e por ultrafiltrações) e por cromatografia líquida multidimensional offline. As frações de interesse obtidas de ES e de EP foram testadas em relação à sua atividade antimicrobiana contra o fungo Alternaria solani e contra as bactérias Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, Gram positiva, e Ralstonia solanacearum, Gram negativa, pela técnica de microplacas, evidenciando a inibição do crescimento desses microrganismos. Os resultados sugerem a ocorrência de aglomerações dos AMPs nos extratos, dadas as características de hidrofobicidade e cargas desses peptídeos, e que as etapas de separação por massas moleculares devem ser realizadas visando reduzir esses efeitos. O procedimento experimental proposto ao final do trabalho, que envolve o fracionamento por sal e por ultrafiltração, seguindo-se cromatografia de fase reversa em C4, permitiu a separação das amostras em frações com atividades antimicrobianas diferentes e potencialmente de interesse para a exploração comercial na defesa de plantas. A construção de um banco de dados que agrupe informações sobre defensinas, possibilitando evidenciar relações entre as moléculas já conhecidas e sequências não identificadas, apresenta-se de grande importância para a complementação dos estudos crescentes sobre esses peptídeos. As bases de dados do DefDB já estão disponíveis e podem ser utilizadas para identificação de sequências obtidas por métodos de sequenciamento, seja pelo alinhamento com a sequência obtida, ou pela identificação comparativa utilizando ferramentas computacionais específicas, como programas e pipelines utilizados para análises de dados de espectrometria de massa. Assim, as informações obtidas desse banco de dados, com a ajuda de ferramentas de análises já disponíveis na rede mundial de computadores, podem colaborar para a identificação de novas sequências, para a elucidação do mecanismo de atuação molecular, além de contribuir para direcionar estudos iniciais sobre esses peptídeos. Portanto, a obtenção de frações com alta atividade antimicrobiana, juntamente com o desenvolvimento de bases de dados específicas, que facilitem a identificação dos possíveis peptídeos antimicrobianos presentes nessas frações, pode ser o caminho para o estudo e o isolamento de novos compostos naturais, capazes de substituir defensivos agrícolas danosos ao ambiente, e/ou serem utilizados como base de medicamentos para combater infecções e doenças imunológicas. === Antimicrobial peptides (AMPs) are expressed by many organisms and have a multifaceted role. Studies have revealed the AMPs as potential antibacterial agents, pesticides, drugs, healing, immune modulators, chemotactic agents, among others. Defensins, the largest family of antimicrobial peptides, are cationic molecules, rich in cysteines, with four disulfide bridges. They consist of 45 to 54 amino acid residues, found in vertebrate and invertebrate organisms, presenting activity against Gram-positive and Gram- negative bacteria, fungi and encapsulated virus. These molecules have low animals and plants toxicity, thereby justifying their use as drugs or pesticides. The defensins act by means of electrostatic attractions with the external surface of the target cell membranes, creating pores and causing the cell death. They also operate, according to recent studies, such as primary and secondary signs in the apoptosis via and as enhancers of immune defenses, being the molecular mechanism of action still unknown. The search for AMPs in plants has been performed at the Laboratório de Proteômica e Bioquímica de Proteínas (DBB / UFV) aiming to characterize the structure of these peptides. The process of separation of peptides was performed by pre-chromatographic step (centrifuging, saline precipitation and ultrafiltration) and offline multidimensional liquid chromatography. The fractions of interest obtained from ES and EP were tested about their antimicrobial activity against the fungus Alternaria solani and against the bacteria Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, Gram positive, and Ralstonia solanacearum, Gram negative, the microplate technique, showing the inhibition of growth of these microorganisms. The results indicated the occurrence of possible agglomeration of AMPs in the extracts, given the characteristics of hydrophobicity and charges of these peptides, and that the separation steps by molecular weight should be carried out to reduce these effects. The experimental procedure proposed by the latter, which involves the fractionation by salt and by ultrafiltration followed by reverse- phase chromatography on C4, allowed the separation of samples into fractions with different antimicrobial activities and potentially of interest to the commercial exploration to the plants defense. The construction of a data bank to collate information about defensins, allowing the construction of relations between the molecules that have been discovered and unidentified sequences, presented as a very important achievement for the complementation of studies about these peptides. The DefDB databases are available and can be used to identify the sequences obtained by sequencing methods, either by aligning the sequence obtained, or by the comparative identification using specific computational tools, such as programs and pipelines used for data analysis of MS. Thus, the information of this data bank, helped by analysis tools already available on the World Wide Web, may contribute to the identification of new sequences, to elucidate the molecular mechanism of action, and contributes to guide initial studies about these peptides. Therefore, the obtation of fractions with high antimicrobial activity, together with the development of specific databases, to facilitate the identification of potential antimicrobial peptides in these fractions, may be the way to the study and isolation of new natural compounds that can replace harmful pesticides to the environment, and/or be used as the basis for drugs to fight against infections and immune disorders. === Dissertação antiga, falta ficha catalog.
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