Molecular characterization of two begomoviruses infecting Pavonia sp. (Malvaceae), and analysis of the intra-host evolution of Tomato severe rugose virus (ToSRV)

• Main Author: Pinto, Vitor Batista
• Other Authors: Zerbini Júnior, Francisco Murilo
• Language: English
• Published: Universidade Federal de Viçosa 2015
• Subjects: Begomovirus; Geminiviridae; Diversidade genética; Quasispecies; Genética Molecular e de Microorganismos
• Online Access: http://www.locus.ufv.br/handle/123456789/6796

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas ([e-mail]) on 2015-11-25T15:48:39Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1728299 bytes, checksum: 9536bb852b8406140722b5b88e410730 (MD5) === Made available in DSpace on 2015-11-25T15:48:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1728299 bytes, checksum: 9536bb852b8406140722b5b88e410730 (MD5) Previous issue date: 2015-07-29 === Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico === A família Geminiviridae é composta por vírus com genoma de DNA circular de fita simples, encapsidado em partículas icosaédricas geminadas. Os vírus pertencentes ao gênero Begomovirus são transmitidos pela mosca-branca Bemisia tabaci a plantas dicotiledôneas. Os begomovírus apresentam taxas de mutação e substituição nucleotídica semelhantes às relatadas para vírus de RNA, e uma elevada taxa de recombinação. Devido ao seu rápido processo evolutivo, novas espécies de begomovírus são frequentemente encontradas no campo. Este trabalho teve como objetivos realizar a caracterização molecular de duas espécies de begomovírus infectando Pavonia sp. (Malvaceae), e quantificar a evolução do Tomato severe rugose virus (ToSRV) em um hospedeiro cultivado e um não-cultivado. Dois begomovírus foram isolados de plantas de Pavonia sp. coletadas nos municípios de Albuquerque e Corumbá, Mato Grosso do Sul. Comparação de sequências e análise filogenética indicaram tratar-se de duas novas espécies com as características de begomovírus bissegmentados das Américas. Foram propostos os nomes Pavonia mosaic virus (PavMV) e Pavonia yellow mosaic virus (PavYMV). No estudo para avaliar a dinâmica evolutiva do ToSRV, plantas de tomateiro e Nicandra physaloides foram inoculadas via biobalística com clone infeccioso do ToSRV e mantidas em casa-de-vegetação. DNA total foi extraído de folhas coletadas aos 30, 75 e 120 dias após a inoculação, e submetido a sequenciamento na plataforma Illumina HiSeq 2000. As bibliotecas de DNA foram submetidas a análise de qualidade no software FastQC. O alinhamento dos reads foi realizado no software Geneious, utilizando o clone infeccioso como sequência referência. Ambos os componentes genômicos do ToSRV apresentam taxa de substituição semelhantes a de vírus de RNA: 3,06 x 10-3 e 2,03 x 10-3 subst/sítio/ano para o DNA-A e DNA-B, respectivamente, em N. physaloides, e 1,38 x 10-3 e 8,68 x 10-4 subst/sítio/ano para o DNA-A e DNA-B, respectivamente, em tomateiro. Valores de taxa de substituição similares aos já descritos para begomovírus foram encontrados também para os genes CP, Rep, MP e NSP em ambos os hospedeiros. Foram quantificadas substituições sinônimas e não- sinônimas, transversões e transições, além de deleções e inserções nos genes CP, Rep, MP e NSP. Foi observado um decréscimo no número de variações ao longo do tempo e consequente aumento do número de sítios idênticos ao genoma referência. Nas bibliotecas provenientes de N. physaloides foi observada a supressão dos códons de terminação dos genes MP e NSP em todo decorrer da infecção, sugerindo uma estratégia adaptativa. O cálculo da entropia de Shannon identificou como hotspots de mutação a região N-terminal do gene Rep, as regiões comuns no DNA-A e DNA-B (CR-A e CR-B, respectivamente) e a região intergênica longa entre os genes MP e NSP no DNA-B (LIR-B). Estes dados sugerem que o ToSRV evolui como quasispecies, apresentando elevada variabilidade genética, o que poderia explicar em parte sua prevalência no campo. === The family Geminiviridae is comprised of viruses with a circular, single-stranded DNA genome encapsidated in twinned icosahedral particles. The viruses in the genus Begomovirus are transmitted by the whitefly Bemisia tabaci to dicot plants. Begomoviruses have mutation and nucleotide substitution rates similar to those reported for RNA viruses, and a high frequency of recombination. Due to their rapid evolutionary process, new begomovirus species are often found in the field. This study aimed to perform the molecular characterization of two begomovirus species infecting Pavonia sp. (Malvaceae), and to follow and quantify the evolution of Tomato severe rugose virus (ToSRV) in a cultivated and a non-cultivated host. Two begomoviruses were isolates from Pavonia sp. plants collected in the municipalities of Albuquerque and Corumbá, Mato Groso do Sul, Brazil. Sequence comparisons and phylogenetic analysis showed that these were two novels species, with the typical features of bipartite, New World begomoviruses. The names Pavonia mosaic virus (PavMV) and Pavonia yellow mosaic virus (PavYMV) were proposed for the two new species. In the study to evaluate the evolutionary dynamics of ToSRV, tomato and Nicandra physaloides plants were inoculated via biobalistics with an infectious clone of ToSRV and maintained in a greenhouse. Total DNA was extrated from leaves collected at 30, 75 and 120 days after inoculation, and was sequenced in the Illumina HiSeq 2000 platform. The DNA libraries from each of the two hosts were submitted to quality control analysis with FastQC software. The genome assembly was performed with the program Geneious using the infectious clone as reference. Both genomic components of ToSRV showed substitution rates similar to those of RNA viruses: 3.06 x 10-3 and 2.03 x 10-3 sub/site/year for the DNA-A and DNA-B, respectively, in N. physaloides, and 1.38 x 10-3 and 8.68 x 10-4 sub/site/year for the DNA-A and DNA-B, respectively, in tomato. Substitution rates in the range of those already described for other begomoviruses were found also for the CP, Rep, MP and NSP genes in both hosts. We quantified synonymous and non-synonymous substitutions, transversions and transitions, as well as deletions and insertions in the CP, Rep, MP and NSP genes. A decrease in the number of variable sites was observed during the course of the experiment, with a corresponding increase in the number of identical sites to the reference genome. Suppression of the stop codons of the MP and NSP genes was observed in the N. physaloides libraries, suggesting an adaptive strategy. Determination of Shannon entropy indicated mutation hotspots in the N-terminal region of the Rep gene, the intergenic common region in the DNA-A and DNA-B (CR-A and CR-B, respectively) and the long intergenic region between the MP and NSP genes in the DNA-B (LIR-B). Overall, the results indicate that ToSRV evolves as a quasispecies, with a high degree of genetic variability which could be partly responsible for its prevalence in the field.