Produção, purificação e caracterização de uma poligalacturonase do Chrysoporthe cubensis.

• Main Author: Barreto, Elisa da Silva
• Other Authors: Andrade, Milton Hércules Guerra de
• Language: Portuguese
• Published: 2016
• Subjects: Pectinase; Fungos - biotecnologia; Purificação
• Online Access: http://www.repositorio.ufop.br/handle/123456789/6372

Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa de Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto. === Submitted by giuliana silveira ([e-mail]) on 2016-04-12T18:33:25Z No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_ProduçãoPurificaçãoCaracterização.pdf: 1800894 bytes, checksum: 81ba847b0ec8fcfae1907bb11bb2a53e (MD5) === Approved for entry into archive by Gracilene Carvalho ([e-mail]) on 2016-04-12T19:06:39Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_ProduçãoPurificaçãoCaracterização.pdf: 1800894 bytes, checksum: 81ba847b0ec8fcfae1907bb11bb2a53e (MD5) === Made available in DSpace on 2016-04-12T19:06:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_ProduçãoPurificaçãoCaracterização.pdf: 1800894 bytes, checksum: 81ba847b0ec8fcfae1907bb11bb2a53e (MD5) Previous issue date: 2016 === Os objetivos deste trabalho foram cultivar o fungo Chrysoporthe cubensis em diferentes fontes de carbono de baixo custo, para induzir a produção da poligalacturonase, purificar e caracterizar a enzima, para identificar propriedades funcionais interessantes para possíveis aplicações biotecnológicas. O fungo foi cultivado em meio semi sólido (67% de umidade), com farelo de trigo, casca de maracujá e casca de laranja, além disso os resíduos de frutas foram misturados ao farelo nas proporções 1:1, 3:1 e 9:1 (farelo: resíduo de fruta). O fungo apresentou maior produção da poligalacturonase em meio composto por farelo de trigo e casca de maracujá (3:1), com atividade de 41.49 U/g de substrato, sendo 1,32 vezes maior do que no cultivo em farelo de trigo puro. O extrato enzimático bruto foi purificado a partir da cromatografia de troca iônica DEAE-Sepharose, seguida por cromatografia em gel filtração em coluna Sephacryl S-200, exibindo atividade específica de 1117,45U/mg, com aumento de 28,34 vezes e rendimento final de 29,2 %. A massa molecular da poligalacturonase, obtida através de SDS-PAGE 12% foi de, aproximadamente, 40,74Kd. A enzima apresentou pH e temperatura ótimos de 3,5 e 50°C, repectivamente, e meia vida de 4,05 minutos a 50°C. A enzima se manteve estável na faixa de pH de 2,5 a 8,5, apresentando acima de 80% da atividade após 1h. O substrato preferencial da enzima foi o ácido poligalacturônico e o km e Vmax foi de 0,766 mg.mL-1 e 1,88U/mL, respectivamente. Os resultados obtidos neste trabalho indicam que a PG de C. cubensis é uma enzima importante dentro do complexo hidrolítico secretado pelo fungo quando cultivado em SSF, em meio contendo resíduos agroindustriais. __________________________________________________________________________________________________________________ === ABSTRACT : The aims of this study were to cultivate the fungi Chrysoporthe cubensis on differents inexpensive carbon sources, to induce polygalacturonase production, purify and characterize the enzyme to identify interesting functional properties for potential biotechnological applications. The fungi was grown in semi solid (67% moisture) with wheat bran, passion fruit peel and orange peel, in addition, the waste fruits were mixed with the meal in the ratios 1: 1, 3: 1 and 9: 1 (bran: fruit residue). The fungus showed increased production of polygalacturonase in medium composed of wheat bran and passion fruit peel (3: 1), activity of 41.49 U / g substrate, being 1.32 times higher than that in pure culture in wheat bran. The crude extract enzyme was purified from the ion exchange chromatography DEAE-Sepharose, followed by gel filtration chromatography on Sephacryl S200 column exhibiting specific activity 1117,45U / mg, an increase of 28.34 fold and final yield of 29 ,2 %. The molecular weight of the polygalacturonase obtained by SDS-12% PAGE was approximately 40,74Kd. The enzyme showed pH 3.5 and temperature to 50 ° C, respectively, and a half life of 4.05 minutes at 50 ° C. The enzyme remained stable in the pH range of 2.5 to 8.5, with over 80% of activity after one hour of incubation. The preferred enzyme substrate was polygalacturonic acid and the Km and Vmax was 0.766 mg.mL-1and 1,88 U/mL, respectively. The results of this study indicate that C. cubensis PG is an important enzyme in the hydrolytic complex secreted by the fungus when grown in SSF, in medium containing organic residues.