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Previous issue date: 2013-03-15 === Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico === One of the main deleterious factors inherent to the process of canine semen freezing is the large amount of sperm membranes lesions observed in the thawing. The freezing induce some destabilization of cell membrane and changes in the conformation between membrane receptors and ionic channels, promoting the calcium influx and increasing the probability of a premature acrosome reaction (AR), that invalidate the fertilizantion of the oocyte. The calcium is the principal inducing agent of the AR in vitro, and there is not recent reports about the biochemical composition of the seminal plasm and about the calcium levels that prevent the premature AR in the frozen of the domestic dog semen too. This study aimed to evaluate the alkaline phosphatase and cationic composition in seminal plasma of the fractions of dog ejaculate; and also test the effects of calcium amount reducing in freezing medium using the EDTA as a chelating agent. The semen was collected from three half-breed dogs. The sperm-rich fraction (SRF) and the prostatic fraction (PF) were separately collected. Both samples were evaluated by spectrophotometry, measuring the concentrations of calcium, sodium, potassium, alkaline phosphatase (AP), and the freezing medium. The fresh semen was evaluated by classical tests (strength, progressive motility, morphology, and membrane integrity). The remainder was divided into three aliquots that were diluted in a freezing medium based on tris-citrate-egg yolk, glycerol and equex with different concentrations of EDTA. The first treatment did not contain EDTA, treatment 2 contained 0.1% EDTA and the third, 0.25%. The most abundant cation in seminal plasma of these dogs was sodium, followed by potassium and calcium, respectively, both in SRF and in PF, without significant difference between the concentrations of these ions in both fractions. The AP obtained in SRF was significantly higher (p <0.000001) than that obtained in PF. There was a high concentration of calcium in the freezing medium based, that was significantly reduced in the treatments with EDTA. Deleterious effects were observed in all analyzed parameters in thawed semen compared with fresh semen (progressive motility, morphology, and membrane integrity). With the use of fluorescent probes, we did not note significant difference in the percentage of the plasmatic membranes e acrosomal membranes injured among the treatments with different EDTA concentrations. The extracellular medium has high calcium concentration, and despite the EDTA had significantly reduced the extracellular calcium in those treatments that it was added, there was not acrosomal membrane injury reduction in these treatments. This may have been caused because the concentration of this cation still remained high in comparision with its concentration in the original seminal plasma. We note too that the EDTA did not presented deleterious effects on the spermatozoa inside the evaluated parameters. === Um dos principais fatores deletérios, inerentes ao processo de congelamento de sêmen canino, é a grande quantidade de lesões de membranas espermáticas observada ao descongelamento. O congelamento induz a desestabilização das membranas celulares e alterações na conformação de receptores e canais iônicos, promovendo influxo de cálcio para o citosol, aumentando a chance de ocorrer prematuramente a reação acrossomal (RA), o que pode inviabilizar a fertilização do ovócito. O cálcio é reconhecido como o principal agente indutor da RA em espermatozoides de mamíferos. Não existem relatos recentes sobre meios de congelamento de sêmen de cão que contenham concentrações de cálcio preventivas à RA prematura. Os objetivos deste estudo foram avaliar quantitativamente a concentração dos cátions cálcio, sódio e potássio e da enzima fosfatase alcalina nas frações dos ejaculados de cães e também testar o efeito da redução da quantidade de cálcio no meio de congelamento utilizando o EDTA como quelante. Utilizou-se ejaculados de três cães mestiços, coletando em separado a fração rica em espermatozoides (FR) e a fração prostática (FP). Ambas foram avaliadas por espectrofotometria para aferição das concentrações dos cátions e da FA, assim como os meios de congelamento utilizados. O sêmen fresco foi avaliado por meio de testes clássicos (vigor, motilidade, hiposmótico e morfologia espermática) e o restante foi dividido em três alíquotas para diluição em meio base de congelamento tris-citrato- gema de ovo com glicerol e equex, meio básico contendo 0,1% de EDTA e meio básico contendo 0,25% de EDTA. O cátion estudado que se apresentou mais abundante no plasma seminal foi o sódio, seguido pelo potássio e o cálcio, tanto na FR quanto na FP, não havendo diferença entre as concentrações em ambas as frações (p >0,05). A FA obtida na FR foi maior que a obtida na FP (p<0,05). Observou-se elevada concentração de cálcio no meio base de congelamento, a qual foi reduzida nos tratamentos com EDTA (p<0,05). Houve efeitos deletérios em todos os parâmetros analisados no sêmen descongelado em comparação com o sêmen fresco (vigor, motilidade, integridade de membrana plasmática e morfologia). Não foi observada diferença na avaliação de lesões nas membranas plasmática e acrossomal com uso de sondas fluorescentes entre os meios com diferentes concentrações de EDTA (p>0,05). Embora o uso de EDTA tenha reduzido o cálcio extracelular, a concentração deste cátion permaneceu alta em comparação com sua concentração original no plasma seminal, fator que pode ser responsável pela não redução de lesões de membrana acrossomal nos tratamentos com EDTA. Por outro lado o EDTA não apresentou efeito deletério sobre os espermatozoides de acordo com os parâmetros avaliados.
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