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Previous issue date: 2009-12-09 === Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior === Polyphenols found in mango pulp, including gallotannins, flavonol glycosides, gallic acid, benzophenone derivatives and mangiferin have shown anticancer activity. Biological activities of polyphenols have been related to their bioavailability. Deglycosylation by β-glucosidases is a critical step in the metabolism and absorption of dietary polyphenols in humans, which might influence their anticancer properties. The objective of this study was to elucidate the anti-cancer effects of mango polyphenols of several varieties (Francis, Kent, Ataulfo, Tommy Atkins and Haden) in different types of cancer. The antiproliferative effects of mango polyphenols were studied in vitro using different cancer cell lines including Molt-4 leukemia, A-549 lung, MDA-MB-231 breast, LnCap prostate, SW-480 colon cancer cells and the non-cancer colon cell line CCD-18Co. Molecular mechanisms involved on the anti-cancer activities of mango polyphenols were assessed. The effect of mango polyphenols on gene expression, cell cycle regulation and reactive oxygen species production on colon cancer cells SW-480 were investigated by RT-PCR, flow cytometry and fluorescence intensity measurement, respectively. The effect of the hydrolysis of mango polyphenols with β-glucosidase on their antioxidant activity, cancer cell-growth suppression activity and in vitro intestinal absorption through human colon adenocarcinoma Caco-2 cell monolayers was evaluated. In addition, the antiproliferative effect of high and low molecular weight polyphenols rich-fractions on colon (SW-480) and breast (MDA-MB-231) cancer cells was studied. Cell lines were incubated with Ataulfo and Haden phenolic extracts, which were selected based on their superior antioxidant capacity compared to the other varieties. Ataulfo and Haden polyphenols inhibited the growth of all human cancer cell lines. SW-480 (colon cancer), MOLT-4 (leukemia) and MDA-MB-231 (breast-cancer) were statiscally equally most sensitive to Ataulfo, whereas SW-480 and MOLT-4 were the most sensitive cell lines to Haden, as determined by cell counting. The efficacy of phenolic extracts from all mango varieties in inhibiting cell growth was tested on SW- 480 colon carcinoma cells. Ataulfo and Haden demonstrated superior efficacy, followed by Kent, Francis and Tommy Atkins. At 5 mg GAE/L, Ataulfo inhibited the growth of colon SW-480 cancer cells by ~79% while the growth of non-cancer colonic myofibroblasts CCD-18Co cells was not inhibited. The growth inhibition exerted by Ataulfo and Haden polyphenols on SW-480 cells was associated with an increased mRNA expression of pro-apoptotic biomarkers (caspase 8, Bax and Bim) and cell cycle regulators (PKMYT1), cell cycle arrest and an alteration in the generation of reactive oxygen species. Phenolic extracts from mango pulp contained gallic acid, mangiferin, phenolic acid derivatives and gallotannins, which were characterized by HPLC-DAD and HPLC-ESI-MSn analysis before and after enzymatic hydrolysis (0.17 mg β- glucosidase 1000 KU/g mango pulp/ 4 h / 35°C). Phenolic acids including gallic, caffeic, ferulic, p-coumaric and p-hydroxybenzoic acids consisted the main compounds derived from enzymatic hydrolysis. Caco-2 cell monolayers were incubated for 2h on the apical side with hydrolyzed and non-hydrolyzed mango extracts. Gallic, caffeic, ferulic, p-coumaric, vanillic and p-hydroxybenzoic acids were detected on the basolateral side for hydrolyzed extract but only gallic acid was detected for the nonhydrolyzed extract. High molecular weight polyphenols, mangiferin and gallotannins, were not transported. Mango pulp polyphenols (control) from all varieties inhibited the proliferation of HT-29 colon (0-27 μg of gallic acid equiv/mL) and MDA-MB-231 breast (0-24 μg GAE/ mL) human cancer cells by up to 99.8 and 89.9 %, respectively. Despite enhanced absorption facilitated by enzymatic hydrolysis, a significant increase in antioxidant activity, phenolic content and antiproliferative effects on breast and colon cancer cells was not observed. Additionally, both high (422; 788-1852 Da) and low (138-194 Da) molecular weight polyphenols rich-fractions equally inhibited cell proliferation of colon and breast cancer cells at the same extent (0-20 μg of gallic acid equiv/mL), which may indicate that the anti-cancer efficacy of mango polyphenolics is not dependent on enzymatic hydrolysis. These results corroborate previous findings from in vivo studies, which suggest that the most of mango polyphenols are not absorbed intact through the small intestine, but may be hydrolyzed by intestinal enzymes into low molecular weight aromatic acids, which would be later absorbed; or when polyphenols are not absorbed, they likely reach the large intestine, modulating the gut microflora, and thus they contribute to reduce the risk of colon carcinogenesis. Overall, polyphenols from several mango varieties exerted anti-cancer effects, and these effects may not require enzymatic hydrolysis by β-glucosidase. === Polifenóis presentes em polpa de manga, incluindo galotaninos, glicosídeos de flavonóides, ácido gálico, derivados da benzofenona, e mangiferina, têm demonstrado propriedades anticarcinogênicas. A etapa de deglicosilação por β-glicosidases tem se mostrado necessária ao metabolismo e à absorção de polifenóis derivados da dieta pelo organismo humano, o que poderia influenciar suas propriedades anticarcinogênicas. O objetivo deste estudo foi elucidar os efeitos anticarcinogênicos de polifenóis extraídos da polpa de manga de diferentes variedades (Francis, Kent, Ataulfo, Tommy Atkins e Haden) em diferentes tipos de câncer. Os efeitos antiproliferativos de polifenóis de manga foram estudados utilizando modelos in vitro de cultura de células cancerosas, incluindo as linhagens celulares de câncer humano Molt-4 (leucemia), A-549 (câncer de pulmao), MDA-MB-231 (câncer de mama), LnCap (câncer de próstata), SW-480 (câncer de colón) e células de colón não cancerosas CCD-18Co. Os mecanismos moleculares envolvidos nas propriedades anticarcinogênicas de polifenóis de manga foram investigados. O efeito do tratamento com polifenóis na expressão gênica, na regulação do ciclo celular e na produção de espécies reativas de oxigênio em células cancerosas de colón humano SW-480 foi investigado por RT-PCR, citometria de fluxo e quantificação da intensidade de fluorescência, respectivamente. Além disso, o efeito da hidrólise de polifenóis de manga pela enzima β-glicosidase na atividade antioxidante, na supressão do crescimento tumoral e na absorção intestinal in vitro através da monocamada de células de adenocarcinoma de colón humano Caco-2 foi avaliado. Ademais, o efeito antiproliferativo de frações fenólicas enriquecidas com polifenóis de baixo e elevado peso molecular em células cancerosas de colón (SW-480) e mama (MDA-MB-231) foi estudado. Células cancerosas foram tratadas com extratos fenólicos das variedades Ataulfo e Haden, as quais foram selecionadas em razão da maior capacidade antioxidante quando comparada a outras variedades. Polifenóis de Ataulfo e Haden inibiram o crescimento de todas as linhagens celulares. SW-480 (câncer de cólon), MOLT-4 (leucemia) e MDA-MB-231 (câncer de mama) apresentaram igualmente maior sensibilidade ao tratamento com polifenóis de Ataulfo, enquanto SW- 480 e MOLT-4 mostraram-se mais sensíveis ao tratamento com polifenóis de Haden, segundo resultados obtidos por contagem de células. O efeito antiproliferativo dos extratos fenólicos de todas as variedades de manga foi avaliado em células cancerosas de colón humano (SW-480). As variedades Ataulfo e Haden demonstraram maior efeito supressor, seguidas de Kent, Francis e Tommy Atkins. Quando células cancerosas de colón SW-480 foram tratadas com 5 mg GAE/L de polifenóis de Ataulfo, o crescimento celular foi inibido em ~79%, enquanto a proliferação de miofibroblastos não cancerosos CCD-18Co não foi inibida. A supressão do crescimento celular pelo tratamento com polifenóis de Ataulfo e Haden em células de câncer de colón SW-480 foi associada com o aumento na expressão gênica de biomarcadores de apoptose (caspase 8, Bax e Bim) e reguladores do ciclo celular (PKMYT1), atraso do ciclo celular e alteração na produção de espécies reativas de oxigênio. Os extratos fenólicos da polpa de manga continham ácido gálico, mangiferina, derivados de ácidos fenólicos e galotaninos, os quais foram caracterizados por análises em HPLC-DAD e HPLC-ESI-MSn antes e após a hidrólise enzimática (0.17 mg β-glicosidase 1000 KU/g polpa de manga / 4 h / 35°C). Ácidos fenólicos incluindo ácido gálico, caféico, ferúlico, p-coumárico e p-hidroxibenzóico consistiram os principais compostos derivados da hidrólise enzimática. Monocamadas de células Caco-2 foram incubadas por 2h no compartimento apical com extratos controle e hidrolisado. Quando incubadas com o extrato hidrolisado, ácido gálico, caféico, ferúlico, p-coumárico, vanílico e p-hidroxibenzóico foram detectados no compartimento basolateral, enquanto apenas ácido gálico foi detectado quando as células foram tratadas com o extrato controle. Polifenóis de elevado peso molecular, incluindo mangiferina e galotaninos, não foram transportados. Polifenóis de polpa (controle) de todas as variedades inibiram a proliferação de células humanas de câncer de colón HT-29 (0-27 μg de ácido gálico equiv./mL) e de mama MDA-MB-231 (0-24 μg GAE/mL) em até 99.8 e 89.9 %, respectivamente. Apesar da hidrólise enzimática ter aumentado a absorção de polifenóis de manga, não houve aumento significativo na atividade antioxidante, no conteúdo fenólico e na supressão do crescimento de células cancerosas de colón e mama. Ademais, ambas as frações fenólicas enriquecidas com polifenóis de baixo (138-194 Da) e elevado (422; 788-1852 Da) peso molecular inibiram o crescimento de células cancerosas de colón e mama na mesma extensão (0- 20 μg GAE/mL), o que poderia indicar que a atividade anticarcinogênica de polifenóis de manga seria independente da hidrólise enzimática. Estes resultados corroboram resultados obtidos em estudos in vivo, que sugerem que a grande parte dos polifenóis não seriam absorvidos em sua forma intacta através do intestino delgado, mas poderiam ser hidrolisados por enzimas intestinais em ácidos aromáticos de baixo peso molecular, os quais seriam posteriormente absorvidos; ou ainda, quando não absorvidos, poderiam, alcançar o intestino grosso, modulando a microflora intestinal e, desta forma, contribuiriam para reduzir o risco de câncer de cólon. Desta forma, polifenóis de polpa de manga de diferentes variedades exibiram efeitos anticarcinogênicos em modelos de cultura de células, os quais poderiam não ser necessariamente dependentes da hidrólise enzimática pela β-glicosidase.
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