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Previous issue date: 2015-03-13 === Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior === Neste trabalho foi construída uma biblioteca metagenômica a partir de um consórcio microbiano termofílico com aproximadamente 135.000 clones, abrigando cerca de 3,5 Gpb de DNA metagenômico. Essa biblioteca foi construída com o objetivo de identificar genes que codificam enzimas lignocelulolíticas para serem expressos na levedura Kluyveromyces marxianus CCT 7735 (UFV-3). De 6.720 clones analisados (5 % do total), foram obtidos 182 hits positivos para atividades de celulases, xilanases e β-glicosidases, com seleção e sequenciamento de 30 fosmídeos que deram origem à identificação de 34 ORFs codificando para enzimas glicosil hidrolases, relacionadas com a hidrólise de celulose e hemicelulose. Paralelo à construção da biblioteca, foi obtido uma linhagem de K. marxianus CCT 7735 (UFV- 3) mutante (ura3 ̄ ). Pela primeira vez nesta levedura a deleção deste gene foi realizada utilizando-se a técnica split-marker, com seleção dos mutantes primeiramente em placas contendo geneticina e, posteriormente, associados à seleção em placas contendo ácido 5-fluorótico (5-FOA). Os resultados apresentados mostram que esta técnica de deleção pode ser eficientemente empregada para K. marxianus CCT 7735 (UFV-3), mesmo levando-se em conta a diploidia desta linhagem. A partir da obtenção do mutante ura3 ̄ , deu-se a construção do vetor pKmLPG para ser usado como sistema de expressão para essa levedura, uma vez que a marca de seleção contida neste vetor é o gene URA3. A característica diferencial e promissora deste sistema de expressão é o uso da sequência do promotor do gene que codifica a enzima endo-polygalacturonase endógena de K. marxianus CCT 7735 (UFV-3). A confirmação do vetor pKmLPG será realizada por sequenciamento. Sem essa confirmação, utilizou-se então o vetor de expressão pKMCL para clonagem de três genes de β-glicosidase isolados a partir da biblioteca fosmidial na levedura K. marxianus CCT 7735 (UFV-3). O vetor pKMCL é derivado do vetor de expressão pKLAC2 de K. lactis e utiliza a marca de seleção que confere resistência ao antibiótico geneticina. Por realização de teste enzimático dos transformantes em meio sólido, observou-se a presença de atividade extracelular de β-glicosidase endógena de K. marxianus CCT 7735 (UFV- 3). Com o genoma desta levedura anotado, foi possível identificar o gene, e juntamente com os demais genes de β-glicosidase (P3Gli, P8Gli e P9Gli), foram preditas as estruturas tri-dimensionais dessas proteínas. A confirmação dos transformantes para os genes P3Gli, P8Gli e P9Gli foi realizada por PCR, e atividade de β-glicosidase foi detectada tanto no sobrenadante extracelular quanto na região do periplasma em oito das nove cepas transformantes analisadas. Os resultados de expressão heteróloga de β-glicosidades em K. marxianus CCT 7735 (UFV-3) mostram que esta linhagem pode ser usada como hospedeira na expressão de diferentes genes lignocelulolíticos, com expectativa de uso das linhagens recombinantes capazes de secretar celulases visando a produção de etanol celulósico. === A metagenomic library harboring around 3,5 Gpb was constructed from a thermophilic microbial consortium. The aim of this library was to identify genes coding lignocellulolytic enzymes that could be expressed in the yeast Kluyveromyces marxianus CCT 7735 (UFV-3). In total, 6,720 clones (5% of all clones) were analysed and 182 positive hits were found for cellulases, xylanases and β-glucosidases. The sequencing of 30 selected fosmids resulted in the identification of 34 putative open reading frames (ORFs) coding glycoside hydrolases involved with cellulose and hemicellulose degradation. Simultaneously, a defective mutant strain of K. marxianus CCT 7735 (UFV-3) for gene ura3 was obtained. The gene was deleted by using, for the first time in this yeast, the split- marker technique that consisted in a first selection of mutants in solid medium with the antibiotic geneticin followed by a second selection in the presence of 5- Fluoroorotic Acid. The results presented here demonstrated the efficiency of the split-marker technique in K. marxianus CCT 7735 (UFV-3), even though this is a diploid strain. Once the ura3 - was obtained, the vector pKmLPG was constructed using the URA3 as a marker gene in order to have an expression system for the ura3 - mutant strain. The differential and promising feature of this vector lies in the presence of the promoter sequence of the gene coding an endo-polygalacturonase enzyme from K. marxianus CCT 7735 (UFV-3). The confirmation of the correct vector construction will be performed by sequencing. In order to express genes isolated from the metagenomic library in the yeast K. marxianus CCT 7735 (UFV-3) three genes coding β-glucosidase were cloned onto the vector pKMCL. This vector is derived from pKLAC2 of Kluyveromyces lactis and it uses the resistance gene for the antibiotic geneticin as a marker. Extracellular activity of endogenous β- glucosidase from K. marxianus CCT 7735 (UFV-3) was detected by enzymatic assay in solid medium during the analyses of transformants, and based in the annotated genome of this yeast, was possible to identify the β-glucosidase gene. The three dimensional structure of the endogenous protein as well from those codified by the β-glucosidase genes (P3Gli, P8Gli and P9Gli) were predicted. The confirmation of transformants for the cloned genes P3Gli, P8Gli and P9Gli was done by PCR, and the β-glucosidase activity was detected in both extracelllular supernatant and periplasm region in eight of nine transformants analysed. Results of heterologous expression of β-glucosidase in K. marxianus CCT 7735 (UFV-3) demonstrated that this strain can be used as a host for expression of various lignocellulolytic genes, with the expectation to use recombinant yeast strains capable to secret celulases targeting the production of cellulosic etanol. === Tese liberada do Sigilo pelo departamento em 04-04-2017, ver arquivo
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