Estudo da alfa amilase de Bacillus koreensis isolado de ecossistema aquático da Amazônia: clonagem molecular, expressão e caracterização

• Main Authors: Neves, Rogério de Oliveira, 92-98238-4124
• Other Authors: [e-mail]
• Format: Others
• Language: Portuguese
• Published: Universidade Federal do Amazonas 2018
• Subjects: Bacia Amazônica; Rio Negro; Rio Solimões; Rio Mamori; Vetor pDMU01; AMYKOR; CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
• Online Access: https://tede.ufam.edu.br/handle/tede/6674

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No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) Previous issue date: 2018-06-28 === FAPEAM - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas === The Amazon region has an immense Biodiversity of aquatic ecosystems of the planet and several biochemical pathways in these aquatic ecosystems, acting in the recycling of the organic carbon, such as the alpha amylase. For this, the objective of this work was to isolate amylolytic bacteria from Amazonian aquatic ecosystems, selection of a good alpha amylase producer, cloning and expression of the alpha amylase gene (Amy). In order to isolate the colony forming units (CFUs) and to identify the qualitative and quantitative amylolytic enzyme activity, besides cloning the AMYKOR gene of the alpha amylase and expressing it in E. coli. The water samples were collected in the Negro, Solimões and Mamori rivers, and later, clones with the ability to hydrolyze starch were identified. It was then extracted from the total DNA of the amylolytic bacteria for amplification of the Ribosomal 16 S RNA and alpha-amylase genes for molecular taxonomic identification. Sequence analysis showed that Bacillus koreensis was the best producer of alpha-amylase. Subsequently, sequences of the alpha amylase gene were sent to the chemical synthesis, which was subsequently cloned and expressed in E. coli. B. koreensis and the recombinant alpha-amylase producing E. coli clone were cultured in 50 ml LB medium with shaking at 30 °C and 37 °C respectively. Cells were removed by slow speed centrifugation and the enzymes from supernatants precipitated with 50% ethanol, recovering a total of 106 units of alpha amylase (recombinant) and 120 units of wild alpha amylase from Bacillus koreensis). The results of the biochemical characterization showed that both the natural and the recombinant enzyme presented optimum pH equal to 6 and optimum temperature of 60 °C, for both enzymes studied. We verified the parameters of apparent enzyme kinetics of Km of 4.8 mg / mL and the apparent maximum rate of 2.6 mg-1. mL-1. minute-1 of the recombinant alpha amylase, as well as apparent enzyme kinetics parameters of apparent Km of 4.0 mg / ml and the apparent maximum rate of 2.3 mg-1. mL-1. minute-1 of the wild-type alpha amylase from Bacillus koreensis. It can be seen that both natural and recombinant alpha amylase exhibited optimum temperatures, optimum pHs and similar kinetic parameters. These parameters indicate that the enzyme has potential for industrial use. === A região amazônica possui uma imensa Biodiversidade de ecossistemas aquáticos do planeta e várias vias bioquímicas nestes ecossistemas aquáticos, atuando na reciclagem do carbono orgânico, tal como, a alfa amilase. Para isto, o objetivo deste trabalho foi isolar bactérias amilolíticas dos ecossistemas aquáticos da Amazônia, seleção de um bom produtor de alfa amilase, clonagem e expressão do gene da alfa amilase (Amy). Com o propósito de isolar as unidades formadoras de colônias (UFC’s) e identificar a atividade enzimática amilolítica qualitativa e quantitativa, além de, clonar o gene AMYKOR da alfa amilase e expressar em E. coli. A mostras de água foram coletadas nos rios Negro, Solimões e o Mamori, e posteriormente, foram identificados clones com a capacidade de hidrolisar amido. A seguir, foi extraído do DNA total das bactérias amilolíticas para amplificação dos genes de RNA Ribossomal 16 S e do gene de alfa-amilase para identificação taxonômica molecular. As análises das sequências mostraram ser Bacillus koreensis o isolado melhor produtor de alfaamilase. Subsequentemente, foi enviado para a síntese química a sequências do gene alfa amilase, que posteriormente, foi clonado e expresso em E. coli. O B. koreensis e o clone recombinante de E. coli produtores de alfa-amilase foram cultivados em 50 mL meio LB com agitação a 30ºC e 37ºC respectivamente. A células foram retiradas por centrifugação a baixa velocidade e as enzimas dos sobrenadantes precipitadas com etanol 50%, recuperandose um total de 106 unidades de alfa amilase (recombinante) e 120 unidades de alfa amilase selvagem de Bacillus koreensis). Os resultados da caracterização bioquímica mostraram que tanto a enzima natural como a recombinante apresentaram pH ótimo igual a 6 e temperatura ótima de 60 °C, para ambas as enzimas estudadas. Verificamos os parâmetros da cinética enzimática aparente de Km de 4,8 mg/mL e a velocidade máxima aparente de 2,6 mg-1 . mL- 1 . minuto-1 da alfa amilase recombinante, bem como, os parâmetros da cinética enzimática aparentes de Km aparente de 4,0 mg/mL e a velocidade máxima aparente de 2,3 mg-1 . mL-1 . minuto-1 da alfa amilase selvagem do Bacillus koreensis. Pode-se verificar que tanto a alfa amilase natural como a recombinante apresentaram temperaturas ótimas, pHs ótimos e parâmetros cinéticos similares. Esses parâmetros indicam que a enzima tem potencial para uso industrial.