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Previous issue date: 2014-06-06 === FAPEAM - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas === Human malaria being a tropical and parasitic disease of medical, social and
economic relevance represents one of the most important public health problems in
the world. Given of resistance of the insect vector to insecticides, research of new
tools for vector control has been proposed. The most fascinating alternative is based
on the use of enzyme inhibitors that play an important and fundamental role in the
metabolism and physiology of the insect. One of this enzyme is trehalose-6-
phosphate phosphatase that dephosphorylates trehalose-6-phosphate substrate,
forming trehalose disaccharide and inorganic phosphate. Trehalose is a dimer of
glucose found in plants, insects and microorganisms. In that organisms trehalose is
important to different roles, of which is to serve as a site of glucose storage for
energy and/or synthesis of cellular components, another role is to protect the cells
against environmental stresses such as desiccation and freezing, and to stabilize
proteins against denaturation. Therefore, this study aimed to clone and express
trehalose-6-phosphate phosphatase (TPP) gene from Anopheles gambiae mosquito
in the methylotrophic yeast Pichia pastoris and to analyze recombinant enzyme
expressed in this yeast. According to results, was demonstrated that TPP enzyme
from A. gambiae has been efficiently expressed in P. pastoris and secreted into the
cell culture supernatant as analyzed by Western blotting. By the electrophoretic
profile in SDS-PAGE gel, after the purification procedure, has been revealed that
recombinant TPP enzyme of TPP 61 clone has a molecular weight of ~ 36 kDa. The
characterization of enzyme presented an optimum pH of 8.0 and optimum
temperature of 38 °C. The kinetic constants of enzyme indicated a KM of 3.19 ± 0.10
mM and Vmax of 290.0 ± 3.78 μmol.min-1. The two-way ANOVA test revealed
significant inhibition of recombinant TPP for EDTA (p <0.0001), NaF (p <0.0001),
CaCl2 (p <0.001) and Ca(NO3)2 (p <0.0001) at 25 mM concentration, while CaCl2 (p
<0.001) and Ca(NO3)2 (p <0.05) compounds were significant for inhibition enzyme at
5 mM concentration. === A malária humana por ser uma doença tropical e parasitária de relevância médica,
social e econômica, representa um dos mais importantes problemas de saúde
pública no mundo. Em vista à resistência do inseto-vetor aos inseticidas, a pesquisa
de novas ferramentas para o controle do vetor tem sido proposta. Uma das
alternativas mais fascinantes baseia-se no uso de inibidores de enzimas que
desempenham papel importante e fundamental no metabolismo e fisiologia do
inseto. Uma destas enzimas é a trealose-6-fosfato fosfatase atuante na rota
metabólica da trealose que desfosforila a molécula de trealose-6-fosfato, formando
como produtos o dissacarídeo trealose e fosfato inorgânico. A trealose é um dímero
de glicose encontrado em plantas, insetos e micro-organismos. Nestes organismos
acredita-se ser importante para diversos papéis, um dos quais é servir como sítio de
armazenamento de glicose para energia e/ou para a síntese de componentes
celulares, outro papel é proteger as células contra pressões ambientais, tais como
dessecação e congelamento, e para estabilização de proteínas contra a
desnaturação. Por esse motivo, este trabalho teve como objetivo clonar e expressar
o gene da trealose-6-fosfato fosfatase (TPP) de Anopheles gambiae na levedura
metilotrófica Pichia pastoris e analisar a enzima recombinante expressa na levedura.
De acordo com os resultados obtidos, foi possível demonstrar que a enzima TPP de
A. gambiae foi expressa eficazmente na levedura P. pastoris e secretada no
sobrenadante da cultura celular, conforme análise por Western blotting. Pelo perfil
eletroforético em gel SDS-PAGE, após procedimento de purificação, foi revelado que
a enzima TPP recombinante do clone TPP 61 tem massa molecular de ~36 kDa. A
caracterização da enzima apresentou pH ótimo de 8,0 e temperatura ótima de 38 ºC.
As constantes cinéticas da enzima indicaram um KM de 3,19 ± 0,10 mM e Vmáx de
290,0 ± 3,78 μmol.min-1. A análise de variância (ANOVA) com dois fatores revelou
inibição significativa da TPP recombinante para EDTA (p <0,0001), NaF (p <0,0001),
CaCl2 (p <0,001) e Ca(NO3)2 (p <0,0001) na concentração de 25 mM, enquanto que
na concentração de 5 mM os compostos CaCl2 (p <0,001) e Ca(NO3)2 (p <0,05)
foram significativos na inibição da enzima.
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