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Previous issue date: 2014-07-10 === CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior === Tuberculosis (TB) caused by Mycobacterium tuberculosisis one of the most lethal diseases in the world, causing millions of deaths every year. Due to the inadequate treatment and the emergence of multidrug-resistant strains, the search for new antimicrobial compounds have been often reported in the scientific literature. Drugs developed from natural products have been a frequent research target and promising results have been obtained with the discovery of antimicrobial compounds synthesized by endophytic microorganisms. Previous work demonstrated that an endophytic Aspergillus fumigatusspecies,isolated from Copaifera multijugaHayne (copaíba), produces antimicrobial compounds, which are released into the growth substrate. The direct use of this substrate (fermentation broth) in antibiosis assaysagainst M. tuberculosisin vitro allowed detectingantimicrobial activity against the pathogen when compared to the negative control. So, the objective of this work was the analysis and purification of these compounds by the fractionation of A. fumigatusmutant and non-mutantfermentation broth, aiming the selection of fractions with higher capacityfor inhibitM. tuberculosis. Mutants were obtained by the induction of the fungal culture to ultraviolet lightexposition. The wild and mutant derivatives isolateswere tested for antibiosis against the indicator organism, Staphylococcusaureusandthe antimicrobial activity has been evaluated by comparing in vitro antibiosis assaysand fungal extractson n-butanol by High Performance Liquid Chromatography (HPLC). After, n-butanolextracts of wild isolates were subjected to fractionation by Medium PressureLiquid Chromatography (MPLC), and the fractions were evaluated against M. smegmatis. After this test, the fractions that showed antagonistic activity were selected for testing against M. tuberculosis, and analyzed in analyticalHPLC. Among 18 mutants selected, eight showed antagonismagainst S. aureus. A peak with less than a minute of retention was correlated with the antimicrobial activity. On the fractionation, 30 fractions were obtained and among these, only two (F4 and F13) showed activity against M. smegmatisandonly F4 showed antagonism against M. tuberculosiswith an MIC of 256µg/mL. The chromatograms of both F4 andF13 showedpeaks atthe beginning of the analysis. The F4chromatogram showedtwo peaks with retention times of 2.1 and 2.4 minutes. These data will be useful in future optimization and purification of compounds === A tuberculose (TB), causada por Mycobacterium tuberculosisé uma das enfermidades mais letais do mundo, causando milhões demortes todos os anos. Devido aos tratamentos inadequados e ao surgimento de cepas multirresistentes aos fármacos utilizados nos tratamentos, a busca por novos compostos antimicrobianos tem sido reportada com freqüência na literatura científica. Fármacos desenvolvidos a partir de produtos naturais têm sido um alvo frequente de pesquisa e dentre as perspectivas, resultados promissores têm sido obtidos com a descoberta de compostos antimicrobianos sintetizados por micro-organismos endofíticos. Trabalhos anteriores demonstraram que um fungo endofítico da espécie Aspergillus fumigatusisolado de Copaifera multijuga Hayne (copaíba), produz compostos antimicrobianos, os quais são secretadospara o substrato de crescimento. A utilização direta desse substrato (caldo de fermentação) em testes de antibiose in vitro contra M. tuberculosispermitiram detectar sua atividade antimicrobiana contra o patógeno, quando comparadaao controle negativo. Partindo desse resultado, foi objetivo do presentetrabalhoproceder à análise e purificação desses compostos, através do fracionamento do caldo de fermentação de A. fumigatusmutantes e não mutantes, visando à seleção de frações que apresentem maiorcapacidade de inibição contra M. tuberculosis.Induziu-sea mutação do isolado selvagempor meio da exposição da cultura fúngica à luz ultravioleta. O isolado selvagem e os mutantes derivados desse isolado foram testados quanto à antibiose contrao micro-organismoindicador,Staphylococccusaureus, tendo sido a atividade antimicrobianaavaliada por meio de comparações entre os testes de antibiose in vitroe os cromatogramas dos extratos fúngicos fracionados em n-butanolpor Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE). Após isso, extratos em n-butanolde isolados selvagens foram submetidos ao fracionamento químico por Cromatografia Líquida de Média Pressão (MPLC)e as frações obtidas foram avaliadas contra M. smegmatis. Após este ensaio, as frações que apresentaram antagonismo foram selecionadas para o ensaio contra M. tuberculosis, além de serem analisadasem CLAEAnalítica. Foram selecionadas 18 colônias mutantes e destas, oito apresentaram antagonismo contra S. aureus. A partir da análise dos cromatogramas dos isolados, correlacionou-se à atividade antimicrobiana um pico com menos de um minuto de retenção.No fracionamento químico, foram obtidas 30 frações e destas,apenas duas (F4 e F13)apresentaram atividade contra M. smegmatis.Das duas frações, apenas F4 apresentou antagonismo frente a M. tuberculosiscom CIM de 256µg/mL. Os cromatogramas, tanto de F4 quanto de F13, apresentampicos no início da análise. O cromatograma de F4 mostra dois picos, com tempos de retenção de 2,1 e 2,4 minutos. Esses dados iniciais auxiliarão na otimização e futurapurificação dos compostos.
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