Análise investigativa dos fatores de virulência de cepas selvagens de shigella SPP. in vivo e seu potencial inflamatório

• Main Author: Serra, Paula Taquita
• Other Authors: Nogueira, Patrícia Puccinelli Orlandi
• Format: Others
• Language: Portuguese
• Published: Universidade Federal do Amazonas 2016
• Subjects: Shigella; Cepa Clínica; Shigelose; Resposta Imune; Clinical Strains; Immune Response; CIÊNCIAS BIOLÓGICAS: IMUNOLOGIA
• Online Access: http://tede.ufam.edu.br/handle/tede/5194

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No. of bitstreams: 1 Dissertação Final Paula Taquita Serra.pdf: 5828635 bytes, checksum: 30c415dfffb3ecb7f7e2e64439a68ae5 (MD5) Previous issue date: 2013-09-04 === CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior === Introduction: Shigellosis is a bacillary dysentery caused by Shigella, a gramnegative intracellular human pathogen. One of most common animal models to evaluate Shigella’s immune response is mice pulmonary infection due easy manipulation and similar gut responses. At this study, we have hypothesized how clinical strains isolated from Shigellosis patients had differential immune response expression when compared to standards strains (M90T). Our main proposition was analyze four clinical Shigella strains with distinct virulence genes and M90T immune responses at murine invasion after 24 and 48h infection. Methods: Shigella Clinical Strains were selected through presence of specific virulence genes by PCR. Primers related to immune system were designed. Clinical strains and M90T Shigella were submitted to expression at Fluidigm (Bioamark Platform). Results were analyzed in statistical software R. Results: We grouped analyzed mRNA in five gene sets: Pro Inflammatory (CXCL15, IL-1β, IL-6, IFN-β, TNF-α), Anti Inflammatory (TGF-β1, TGF- β2 e TGF-β3), Innate Response (NOD 1, NOD 2, TLR4 e TLR9), Adaptive Response (Th1-like, IFN-γ, IL-17A e IL-17B) and Macrophage (NOS, H2 -Aβ1, H2-Eβ, H2-K1, MHC-like 2). As main results, all clinical strains displayed a moderate mRNA expression in 24h infection which gets higher in 48h, while M90T standard had opposite regulation with lower mRNA rates in 48h infection, suggesting major differences between well characterized standards and clinical strains. Clinical strain #5 did not alter mRNA expression in 24 and 48h at adaptive immune response genes, suggesting low invasion rates and host control at initial steps of infection. Clinical strain #11 demonstrates high macrophage activity by superior expression levels of IFN-γ and NOS. Strains #14 and #27 suggest potential of Th1 protection through high MHC-like II and Th1 mRNA expression when compared to all other strains and standard control. Presence of IL-17 high expression in strain #27 demonstrates a possible relation with Th17 cells. The immunological potential of strain #27 may have relationship with Shigella enterotoxins (shET1A, shET1B, and shET2). Enterotoxins presence was confirmed by PCR and results shows this complete set is absent in all other strains studied. Conclusion: The differences between clinical strains and standards were evident at this study. Clinical strain 27 appears as a great candidate to future studies and may provide new perspectives about differences among invasion and immune response seen in the clinical practice. === Shigelose é uma disenteria bacilar causada pela Shigella, um patógeno Gram negativo e intracelular. Um dos modelos animais mais comuns para avaliar a resposta imune da Shigella é a infecção pulmonar em camundongos devido a fácil manipulação e similaridade com as respostas intestinais. Neste estudo, nós levantamos a hipótese de como cepas clínicas isoladas de pacientes com shigelose possuem expressão de resposta imune diferencial quando comparados com cepas padrões (M90T). Nossa principal proposta foi analisar quatro cepas de Shigella clínicas com diferentes genes de virulência e a cepa padrão M90T quanto as respostas imunes após invasão murina em 24 e 48h. Métodos: Cepas clínicas de Shigella foram selecionadas pela presença de genes de virulência específicos por PCR. Primers relacionados ao sistema imune foram desenvolvidos. As cepas clínicas e a padrão foram submetidas à análise de expressão gênica pelo Fluidigm (Bioamark Platform). Os resultados foram analisados em programa estatístico R. Resultados: Nós agrupamos os mRNA em cinco grupos: Pró Inflamatórios (CXCL15, IL-1β, IL-6, IFN-β, TNF-α), Anti Inflamatórios (TGF-β1, TGF-β2 e TGF-β3), Resposta Inata (NOD 1, NOD 2, TLR4 e TLR9), Resposta adaptativa (Th1-like, IFN- γ, IL-17A e IL-17B) e Macrófago (NOS, H2 -Aβ1, H2-Eβ, H2-K1, MHC-like 2). Como principais resultados, todas as amostras clínicas demonstraram uma expressão mRNA em 24h de infecção que foi gradativamente aumentado após 48h, enquanto a cepa padrão M90T teve a regulação oposta com taxas de mRNA em 48h, sugerindo grandes diferenças entre as respostas a cepas clínicas e a padrões bem caracterizados. A cepa clínica #5 não alterou a expressão de mRNA em 24 e 48h nos genes da resposta adaptativa, sugerindo baixas taxas de invasão e controle do hospedeiro nas etapas iniciais da infecção. A cepa clínica #11 demonstrou alta atividade macrofágica devido a maior expressão de IFN-γ e NOS. A cepa #14 e #27 demonstraram um possível potencial de proteção Th1 devido a alta expressão mRNA para MHC-like II e Th1 quando comparado a outras cepas e o controle positivo. A presença de alta expressão de IL-17 na cepa #27 relação com células Th17. O potencial imunológico da cepa #27 pode ter relação com as enterotoxinas (shET1A, shET1B e shET2). A presença do conjunto completos destas enterotoxinas foi confirmado na cepa #27 por PCR. Conclusão: As diferenças entre cepas clínicas e padrões foram evidentes neste estudo. Cepa clínica 27 parece ser uma ótima candidata para estudos futuros e pode prover novas perspectivas para as diferenças de invasão e resposta imune vista nos hospitais.