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Previous issue date: 2014-02-17 === CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior === A microbiota vaginal é considerada um ambiente complexo, onde várias espécies bacterianas coexistem e desenvolvem complexas relações. Vaginose bacteriana (VB) é uma síndrome caracterizada por uma depleção de espécies de Lactobacillus predominantes na microbiota vaginal saudável e um aumento de outras espécies, principalmente Gardnerella vaginalis e Atopobium vaginae. O objetivo desse trabalho foi avaliar a microbiota vaginal de pacientes com e sem VB, atendidas no serviço de ginecologia do SUS e da rede privada de Juiz de Fora/MG, quanto a sua diversidade bacteriana e quantificar os principais gêneros e espécies envolvidos na patogênese da doença. Secreção vaginal de pacientes com e sem VB foram coletadas e transportadas para o laboratório, em meio específico. Lâminas foram coradas pelo método de Gram, a fim de estabelecer o escore de Nugent para avaliação das pacientes entre saudáveis e doentes. O DNA total das secreções foi extraído e PCR quantitativa (qPCR) em tempo real foi realizada, utilizando primers específicos para Lactobacillus spp., G. vaginalis, A. vaginae, Mobiluncus spp. e Mycoplasma hominis. A partir do DNA total extraído também foi realizada PCR convencional utilizando primers específicos para Domínio Bacteria e os filos Actinobacteria e Firmicutes, e em seguida foi realizada técnica de Eletroforese em Gel com Gradiente Desnaturante (DGGE). Foi realizada também a técnica de Hibridização Fluorescente in situ (FISH), para identificação e quantificação de bactérias pertencentes aos filos Actinobacteria, Firmicutes, α-Proteobactéria, β-Proteobactéria e γ-Proteobactéria. Entre os grupos saudável e doente (VB) foi observada diferença estatisticamente significativa na quantificação de Lactobacillus spp., G. vaginalis, A. vaginae, Mobiluncus spp. e M. hominis. Lactobacillus spp. esteve presente em maior concentração no grupo saudável enquanto que G. vaginalis, A. vaginae, Mobiluncus spp. e M. hominis estiveram presentes em maior concentração no grupo doente (VB). De um modo geral, a concentração de G. vaginalis e Mobiluncus spp. elevou-se com o aumento do escore de Nugent; em contrapartida, a concentração de Lactobacillus spp., decresceu com o aumento do escore de Nugent. A análise de agrupamento mostrou que, com algumas exceções, os perfis de pacientes apresentando o mesmo status de saúde tenderam a se agrupar juntos, porém em clusters separados e que os agrupamentos parecem ser regidos pelo status de saúde das pacientes. As variáveis riqueza e diversidade revelaram perfis complexos entre as amostras e a análise de componente principal (PCA) mostrou que as amostras dentro do grupo VB tenderam a se agrupar na análise dos filos Actinobacteria e Firmicutes. Não foi observada diferença estatisticamente significativa entre os grupos saudável e doente (VB) em relação a quantificação dos filos Actinobacteria, Firmicutes, α-Proteobactéria, β-Proteobactéria e γ-Proteobactéria. O uso combinado das técnicas DGGE, FISH e PCR quantitativa em tempo real representam uma estratégia bem sucedida para o monitoramento qualitativo e quantitativo de alterações na microbiota vaginal relacionadas a doenças infecciosas, como a vaginose bacteriana. Tal fato pode contribuir tanto para o desenvolvimento de ferramentas que auxiliem no diagnóstico de mulheres acometidas pela VB, especialmente as pacientes assintomáticas, e também pode contribuir com a melhoria e otimização dos regimes terapêuticos adotados na prática clínica para o tratamento da VB. === The vaginal microbiota is considered a complex environment where several bacterial species coexist and develop complex relationships. Bacterial vaginosis (BV) is a syndrome characterized by a depletion of Lactobacillus species prevalent in healthy vaginal microbiota and an increase in other species, especially Gardnerella vaginalis and Atopobium vaginae. The aim of this study was to evaluate the vaginal microbiota of patients with and without BV, attended at the gynecology service of the SUS and the private service of health of Juiz de Fora/MG, as its bacterial diversity and quantify the major genera and species involved in the disease pathogenesis. Vaginal secretions of patients with and without BV were collected and transported to the laboratory in a specific medium. Slides were stained by the Gram method in order to establish the Nugent Score for evaluation of patients between healthy and sick. The total DNA of secretions was extracted and Real-time Polymerase Chain Reaction (qPCR) was performed using specific primers for Lactobacillus spp., G. vaginalis, A. vaginae, Mobiluncus spp. and Mycoplasma hominis. From the total DNA extracted from conventional PCR also was performed using specific primers to Bacteria domain and Actinobacteria and Firmicutes phyla, and then Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) was performed. The identification and quantification of bacteria belonging to the phyla Actinobacteria, Firmicutes, α-Proteobacteria, β-Proteobacteria and γ-Proteobacteria were performed by the technique of Fluorescence in situ Hybridization (FISH). Among the healthy and diseased (VB) groups statistically significant difference was observed in the quantification of Lactobacillus spp., G. vaginalis, A. vaginae, Mobiluncus spp. and M. hominis. Lactobacillus spp. was present in higher concentration in the healthy group while G. vaginalis, A. vaginae, Mobiluncus spp. and M. hominis were present in higher concentrations in the patient group (VB). In general, the concentration of G. vaginalis, and Mobiluncus spp. increased with the increment in the Nugent Score; however, the concentration of Lactobacillus spp decreased with the raise of the Nugent score. The cluster analyses showed that, with few exceptions, the profiles from patients with the same health status grouped together in separate clusters and there was a distinct separation based on the health status of the patients. The richness and diversity showed complex profiles and principal component analysis (PCA) showed that the samples within the VB group grouped together on the analysis of the phyla Firmicutes and Actinobacteria. No statistically significant difference was observed between healthy and diseased groups (VB) for quantification of the phyla Actinobacteria, Firmicutes, α-Proteobacteria, β-Proteobacteria and γ-Proteobacteria. The combined use of techniques DGGE, FISH and real-time quantitative PCR represent a successful strategy for qualitative and quantitative monitoring of changes in vaginal microbiota related to infectious diseases such as Bacterial Vaginosis.This may contribute to both the development of tools that aid in the diagnosis of women affected by BV, especially asymptomatic patients, and may also contribute to the improvement and optimization of therapeutic regimes adopted in clinical practice for the treatment of BV.
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