Desenvolvimento, validação e aplicação de metodologia analítica em CLAE-UV para monitoramento terapêutico de metabólitos da azatioprina em pacientes com doença de Crohn

• Main Author: Ribeiro, Aline Corrêa
• Other Authors: Nascimento, Jorge Willian Leandro
• Language: Portuguese
• Published: Universidade Federal de Juiz de Fora (UFJF) 2018
• Subjects: CNPQ::CIENCIAS DA SAUDE::FARMACIA; Doença de Crohn; Azatioprina; Tiopurina; CLAE-UV; Crohn's Disease; Azathioprine; Thiopurine; HPLC-UV
• Online Access: https://repositorio.ufjf.br/jspui/handle/ufjf/6934

Submitted by Geandra Rodrigues ([e-mail]) on 2018-07-04T14:43:46Z No. of bitstreams: 1 alinecorrearibeiro.pdf: 2333411 bytes, checksum: 7c0df6693f47a6872d99460a06bc865b (MD5) === Approved for entry into archive by Adriana Oliveira ([e-mail]) on 2018-07-06T14:24:16Z (GMT) No. of bitstreams: 1 alinecorrearibeiro.pdf: 2333411 bytes, checksum: 7c0df6693f47a6872d99460a06bc865b (MD5) === Made available in DSpace on 2018-07-06T14:24:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 alinecorrearibeiro.pdf: 2333411 bytes, checksum: 7c0df6693f47a6872d99460a06bc865b (MD5) Previous issue date: 2017-08-29 === Devido à importância que o sistema imune desempenha na doença de Crohn (DC), as tiopurinas são os imunomoduladores mais indicados na terapia. Entretanto, as tiopurinas, como a Azatioprina (AZA) e seus metabólitos intraeritrocitários, levam a uma série de reações adversas ou falha terapêutica, podendo ocasionar em não adesão ou abandono da terapia. A conversão da AZA para os nucleotídeos ativos de 6-tioguanina (6-TGN) é necessária para a eficácia clínica, entretanto, outro metabólito, a 6-metilmercaptopurina (6-MMP), é formado através de uma via concorrente pela tiopurina metil transferase e está relacionado à hepatotoxicidade. Devido à ampla variabilidade interindividual da tiopurina metil transferase e a uma faixa terapêutica estreita, torna-se importante a realização do monitoramento terapêutico do metabólito ativo 6-TGN e da 6-MMP. Neste trabalho, um método cromatográfico (CLAE/HPLC-UV) foi desenvolvido e validado para a quantificação dos metabólitos nos eritrócitos, envolvendo um procedimento de tratamento simples baseado na desproteinização por ácido perclórico seguido de hidrólise ácida e aquecimento para a conversão dos metabólitos em suas respectivas bases livres. A cromatografia foi realizada em coluna C18 (250 x 4,6 mm, 5 μm). A fase móvel consistiu em mistura de solução tampão fosfato de potássio (0,02 mol/L, pH = 3), acetonitrila e metanol, eluição por gradiente, num fluxo de 1,0 mL/minuto, com detecção de UV em 291 ηm e 342 ηm. Os tempos de retenção foram de 6,2 min (6-TGN); 23,1 min (6-MMP) e 24,7 min (cafeína: padrão interno). A resposta do detector foi linear na concentração de 0,89-29,91 μmol/L (r=0,999) para 6-TGN e entre 0,90-30,08 μmol/L (r=0,999) para 6-MMP. Os limites de detecção foram de 0,29 μmol/L e 0,30 μmol/L e os limites de quantificação foram de 0,89 μmol/L e 0,90 μmol/L, para 6-TGN e 6-MMP respectivamente. As médias das recuperações de 87,9% para 6-TGN e 91,9% para 6-MMP. Os CV da repetibilidade, de 5,48 e 10,48% (intradia) e 9,23 e 10,48% (interdia), enquanto os EPR da reprodutibilidade de 11,36 e 9,85% (intradia) e 10,48 e 7,32% (interdia) para 6-TGN e 6-MMP, respectivamente. As concentrações de 6-TGN e 6-MMP foram determinadas para todos os pacientes do estudo e os resultados encontrados variaram de 4,51 a 1515,27 ρmol/8 x 10⁸ eritrócitos para a 6-TGN e de 169,98 a 53951,53 ρmol/8 x 10⁸ eritrócitos para a 6-MMP. Observou-se uma correlação entre os pacientes em terapia combinada AZA e alopurinol e a diminuição da dosagem de AZA, consequentemente a diminuição significativa dos níveis de 6-MMP (2030,71 ρmol/8 x 10⁸ eritrócitos) em comparação com o grupo de pacientes sob monoterapia (9098,43 ρmol/8 x 10⁸ eritrócitos). Um outro achado foi a diminuição estatisticamente significativa da transaminase TGO/AST (25,03 + 18,62 U/L) no grupo de pacientes que apresentavam a doença em atividade, com os níveis de 6-TGN a 540,51 ρmol/8 x 10⁸ eritrócitos e de 6-MMP a 7952,32 ρmol/8 x 10⁸ eritrócitos, semelhante a relatos anteriores da literatura. O método proposto de quantificação por CLAE-UV mostrou-se preciso, exato e reprodutível, podendo ser utilizado como uma importante ferramenta na rotina de monitorização terapêutica de pacientes com DC, permitindo a individualização da dose, o acompanhamento dos efeitos adversos relacionados com a terapia farmacológica, o monitoramento da adesão ao tratamento e a avaliação da evolução clínica do paciente. === The conversion of azathioprine (AZA) to active nucleotides of 6-thioguanine (6-TGN) is essential for clinical efficacy in Crohn's disease. However, other metabolite, 6-methylmercaptopurine (6-MMP), which is formed through a competitive pathway for thiopurine methyltransferase (TPMT), is related to hepatotoxicity of this drug. Due to the wide interindividual variability of TPMT and a narrow therapeutic range it is important to accomplish the therapeutic monitoring of active metabolite 6-TGN and 6-MMP, which is an unusual procedure in Brazil. In this study, a HPLC-UV method for simultaneous quantification of these metabolites was developed, validated and applied in 37 Crohn's disease patients. The chromatographic process was performed on C18 column (250 x 4.6 mm, 5 μm i.d.), mobile phase consisted of potassium phosphate buffer (0.02 mol/L, pH = 3), acetonitrile and methanol, flow rate at 1.0 ml/min and UV detection at 291 ηm and 342 ηm. Retention times were 6.2 min (6-TGN); 23.1 min (6-MMP) and 24.7 min (caffeine: internal standard). The detector response was linear at 0.89-29.91 μmol/L (r=0.999) for 6-TGN and 0.90-30.08 μmol/L (r=0.999) for 6-MMP. Limits of detection were 0.29 μmol/L and 0.30 μmol/L, while the quantification limits were 0.89 μmol/L and 0.90 μmol/L, for 6-TGN and 6-MMP respectively. Precision, accuracy and recovery, were according FDA and ANVISA guidelines. The concentrations of 6-TGN and 6-MMP were determined in patients’ blood and the results found ranged from 4.51 to 1515 ρmol/8 x 10⁸ erythrocytes for 6-TGN and from 169.98 to 53.951 ρmol/8 x 10⁸ erythrocytes for 6-MMP. It was observed a reduction of levels of 6-MMP in patients using AZA + allopurinol therapy (2030.7 ρmol/8 x 10⁸ erythrocytes) when compared with patients undergoing monotherapy (9098.43 ρmol/8 x 10⁸ erythrocytes). Another finding was the correlation between the decrease in GOT transaminase in the group of patients who had the active disease with the increase in the 6-TGN levels, similar to previous reports in the literature. These results indicate that the method developed was reliable, accurate and reproducible, and can be used as an important tool in the routine monitoring of patients with Crohn's disease, allowing the individualization of the dose, the monitoring of the adverse effects related to the pharmacological therapy, monitoring the adherence to the treatment and the evaluation of the clinical evolution of these patients.