Isolamento e localização imunohistoquímica de apirase de galha globosa de Calliandra brevipes BENTH (Fabaceae: Mimosoidae) usando anticorpos contra NTPDases e seu domínio B conservado

• Main Author: Quellis, Leonardo Ramos
• Other Authors: Vasconcelos, Eveline Gomes
• Language: Portuguese
• Published: Universidade Federal de Juiz de Fora (UFJF) 2017
• Subjects: CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS; Solanum tuberosum; Planta; Galha; Apirase; Domínio B; Peptídeos; Anticorpo; Histoquímica; Semente; Plant; Gall; Apyrase; B-domain; Peptides; Antibody; Histochemical; Seed germination
• Online Access: https://repositorio.ufjf.br/jspui/handle/ufjf/5697

Submitted by [e-mail] ([e-mail]) on 2017-08-31T15:40:53Z No. of bitstreams: 0 === Approved for entry into archive by Adriana Oliveira ([e-mail]) on 2017-09-01T11:35:40Z (GMT) No. of bitstreams: 0 === Made available in DSpace on 2017-09-01T11:35:40Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013 === CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior === Por alinhamento das sequências de aminoácidos da apirase de S. tuberosum e isoformas de outras espécies de plantas, alta identidade (46% a 94%) e similaridade (64% a 96%) foram identificadas entre elas, incluindo espécies diferentes de Fabaceae, e estreita relação estrutural foi encontrada entre os domínios B destas proteínas. Anticorpos policlonais anti-apirase de batata S. tuberosum inibiram 65-80% da atividade catalítica desta proteína. Soros imunes policlonais produzidos contra os peptídeos sintéticos homólogos potB1LJ, LbB1LJ e SmB1LJ ou potB2LJ, LbB2LJ e SmB2LJ, derivados de domínios B de isoformas de NTPDases, inibiram significativamente (32-44%) a atividade da apirase de batata. Estes anticorpos podem ser ferramentas moleculares auxiliares para o estudo das isoformas de apirase. A atividade apirásica de tecidos de folha (NL) ou caule (NS) normais e de galha globosa (GG) de Calliandra brevipes BENTH (Fabaceae: Mimosoidae) foi testada em meio de reação pH 7,5 e na presença de C12E9, e a hidrólise de ADP, UDP ou GDP por GG foi 1,8 a 2,4 vezes maiores que tecidos não galhados. Anticorpos policlonais anti-apirase de batata inibiram significativamente (70-90%) a hidrólise de ATP, ADP, GDP ou UDP por NS. Em GG, similarmente, a atividade ATPásica, GDPásica, ADPásica ou UDPásica foi significativamente inibida (40-66%). Para o isolamento e identificação de apirase de tecidos normais e galha globosa de Calliandra brevipes, amostra de tecido de NS ou NL não galhado, ou de GG previamente homogeneizada em Triton X-100 mais deoxicolato de sódio foi fracionada em gel não desnaturante contendo os mesmos detergentes. Usando ADP como o substrato, a atividade catalítica da enzima permitiu o aparecimento de uma única banda de precipitado de fosfato de cálcio mostrando idêntica mobilidade eletroforética nas amostras NS, NL e GG, sendo mais intensa nesta última, sugerindo que a apirase é superexpressa neste tecido. Nesta banda de maior mobilidade, distintos polipeptídeos de 52 a 75 kDa foram reconhecidos pela imunoreatividade cruzada de anticorpos anti-apirase de batata, sugerindo a existência de formas ativas da mesma proteína com diferentes cargas líquidas, possivelmente como um resultado de diferentes níveis de glicosilação. Além disso, uma banda de aproximadamente 52 kDa, de menor mobilidade e atividade, foi também identificada em todos os tecidos, possivelmente a apirase em sua forma completamente deglicosilada. Usando técnicas histoquímicas e microscopia óptica, cortes micrométricos corados por lugol ou azul de astra-safranina evidenciaram a câmara pulpal amplamente circundada por tecido nutritivo contendo amido em sua porção distal, e parênquima cortical delimitado por anéis esclerenquimáticos lignificados. Por técnicas histoquímicas, a atividade ADPásica ou ATPásica foi encontrada como um depósito eletrodenso granular de fosfato de chumbo distribuído na superfície externa, e nos tecidos nutritivos da galha globosa. Por técnicas imunohistoquímicas, usando Microscópio Confocal de Varredura a Laser e anticorpos anti-apirase de batata e anti-peptídeos sintéticos, a apirase de galha globosa foi encontrada nos mesmos sítios. Hipóteses funcionais para esta proteína estão sob investigação. Além disso, o tempo de germinação de semente de C. brevipes foi determinado, e no quinto dia após a instalação do teste, a primeira folha foi aberta, identificando tecidos de crescimento rápido apropriados para a investigação da regulação da hidrólise de ATP por apirase na proliferação celular. === By alignment of amino acid sequences of the S. tuberosum apyrase and isoforms from other plant species, high identity (46 to 94%) and similarity (64 to 96%) were identified between them, including distinct species of Fabaceae, and closer structural relationship was found between the domains B from these proteins. Polyclonal antibodies anti- S. tuberosum potato apyrase inhibited 65-80% of the catalytic activity of this protein. In addition, polyclonal immune sera produced against homologue synthetic peptides potB1LJ, LbB1LJ and SmB1LJ or potB2LJ, LbB2LJ and SmB2LJ, derivatives from B domains of NTPDases isoforms, significantly inhibited (32 to 44%) potato apyrase activity. These antibodies could be useful molecular tools for studies of the apyrase isoforms. The apyrase activity from the non-galled stem (NS), non-galled leaf (NL), or globose gall (GG) tissue from Calliandra brevipes BENTH (Fabaceae: Mimosoidae) was tested in reaction medium pH 7.4 and in the presence of C12E9, the ADP, UDP or GDP hydrolysis by GG was 1.8 to 2.4 fold higher than non-galled tissues. Polyclonal antibodies anti-potato apyrase significantly inhibited (70 to 90%) the ATP, ADP, GDP or UDP hydrolysis by NS. In GG, similarly, the ATPase, GDPase, ADPase or UDPase activity was also significantly inhibited (40-66%). For isolation and identification of apyrase from normal tissues and globose gall from the Calliandra brevipes, sample of NS, NL or GG tissue was previously homogenised in Triton X-100 plus sodium deoxycholate, and fractionated in non-denaturing gel containing the same detergents. Using ADP as the substrate, the enzyme catalytic activity gave rise to the appearance of a single calcium phosphate precipitate band displaying identical electrophoretic mobilities in NS, NL, and GG samples, being more intense in this last one suggesting that apyrase is over-expressed in this tissue. In this band of higher mobility, a number of distinct polypeptides ranging from 52 to 75 kDa were recognized by cross-immunoreactivity with polyclonal anti-potato apyrase antibodies, suggesting the existence of active forms of the same protein with different net charges, possibly as a result of distinct glycosylation levels. In addition, an immunoreactive band of approximately 52 kDa, of lower mobility and activity, was also identified in all tissues, possibly apyrase in completely deglycosylated form. By histochemical techniques and light microscopy, micrometric sections stained with lugol or Astra Blue-Saphranine evidenced the chamber pulpal widely surrounded by nutritive tissue containing starch in its distal portion, and cortical parenchime delimited by rings sclereides lignified. By histochemical techniques, the ADPase or ATPase activity was found as a granular dense lead phosphate deposit distributed at the external surface, and inside of the nutritive cells of the globose gall. By immunohistochemical techniques, using confocal laser scanning microscopy and antibodies anti-potato apyrase and anti-synthetic peptides, the gall globose apyrase was found at same sites. In addition, the time of laboratory germination of C. brevipes seed was determined, and on the fifth day after test installation, the first leaf opened, identifying rapid growing tissues suitable for further investigations on the participation of both apyrase and regulation of ATP hydrolysis in cell proliferation.