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Previous issue date: 2016-12-14 === FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais === Os ruminantes são animais capazes de utilizar a fibra contida nos vegetais como alimento devido a atuação de microrganismos contidos em seu trato digestivo. A prospecção por organismos da microbiota ruminal com potencial capacidade de degradação de celulose e xilana tem grande importância em atividades antrópicas e processos industriais. Foram realizadas coletas semanais de conteúdo ruminal de bovinos fistulados para posterior isolamento de bactérias com o auxílio da metodologia desenvolvida por Hungate (1966) com modificações e outros meios de cultura específicos para microrganismos do rúmem. Os isolados foram avaliados quanto as suas características morfo-tintoriais com o auxílio da coloração de Gram e quanto a motilidade mediante inoculação em meio SIM suplementado. Também foi avaliado o metabolismo energético dos isolados por meio de teste respiratório, assim como o seu perfil enzimático com a utilização de zimogramas. Uma vez caracterizados, os isolados foram acondicionados em freezer -20ºC para caracterização molecular e posterior inclusão na coleção de microrganismos da Embrapa. No total foram obtidos 67 isolados, sendo destes 52 cocos Gram positivos, 10 bacilos Gram negativos e 5 bacilos Gram positivos. O teste de motilidade revelou que apenas 12 dos 67 isolados eram móveis e no teste respiratório observou-se que 14 eram anaeróbios estritos. Os zimogramas demonstraram que 14 isolados são celulolíticos e 53 são xilanolíticos. Pelos kits comerciais de identificação microbiana, das 67 linhagens bacterianas isoladas, 49,3% foram identificadas no nível de espécie com identidade aceitável (15,15%) ou boa identificação (34,15%), enquanto que 50,7% linhagens não foram identificadas pela técnica utilizada. Os isolados foram agrupados em biogrupos, de acordo com as semelhanças em seus perfis bioquímicos, e uma ribotipagem foi realizada com até três integrantes de cada biogrupo. A reação só foi possível com os bacilos Gram positivos e negativos. Um integrante de cada ribotipo e até três de cada biogrupo foram selecionados para amplificação a região do DNA codificadora do rRNA 16S e posterior sequenciamento. Após análise das sequências de DNA resultantes, as
espécies Selenomonas ruminantium, Streptococcus sp., Pseudobutyrivibrio sp. e Lactobacillus vitulinus foram identificadas entre os isolados. Um dos isolados não obteve identificação satisfatória. Foi possível avaliar que não houve alterações significativas no perfil da comunidade bacteriana frente as diferentes dietas. A comparação entre os resultados dos dois métodos de identificação indicou que os kits bioquímicos utilizados no trabalho não são aconselhados para a identificação de bactérias ruminais. O sequenciamento da região do DNA codificadora do rRNA 16S ainda é a forma de identificação mais segura. A identificação de isolados potencialmente celulolíticos e xilanolíticos como Selenomonas ruminantium e Lactobacillus vitulinus constitui novas evidências da presença de atividade fibrolítica em indivíduos dessas espécie. Mais estudos devem ser realizados de forma a comprovar a expressão de fitases por essas bactérias. Os resultados obtidos nesse estudo são importantes para a melhor compreensão do ecossistema ruminal e futuramente podem contribuir para o melhoramento da hidrólise de material lignocelulósico na indústria. === Ruminants are animals capable of utilizing the fiber contained in vegetables as feed due to the microrganisms present in their digestive tract. The prospection of organisms with potential ability to degrade cellulose and xylan in the rumen microbiota is of great importance in anthropogenic activities and industrial processes. Samples of ruminal content were collected weekly from fistulated bovines for later bacteria isolation by making use of the technique described by Hungate (1966) with modifications by Bryant and Burkey (1951). The isolates were evaluated regarding their morphotintorial characteristics by using Gram stain and regarding their motility by inoculation in supplemented SIM media. The isolates energetic metabolism was also evaluated by respiratory test, as well as their enzymatic profile by zymmograms. Once characterized, the isolates were stored in -20ºC freezer for molecular identification and later inclusion in the EMBRAPA microorganism collection. A total of 67 isolated were obtained, of which 52 were Gram positive cocci, 10 were Gram negative rods and 5 were Gram positive rods. The motility test revealed that only 12 out of the 67 isolates were motile and in the respiratory test it was possible to observe that 14 bacteria were obligate anaerobes. The zymmograms showed that 14 isolates were potencially cellulolytic and 53 were potencially xylanolytic. The commercial biochemical identification kits revealed that out of the 67 bacteria, 49,3% obtained species identification with acceptable (15,15%) or good identification (34,15%), while 50,7% were not identified by this technique. The isolates were grouped in biogroups, according to the similarities in their biochemical profiles, and up to three integrals were chosen for ribotyping. The reaction was only possible with the rods. One member of each ribotype and up to three members of each biogroup were selected for amplification of the DNA region that encodes the 16S rRNA and later sequencing. After analysis of the resulting sequences, the species Selenomonas ruminantium, Streptococcus sp., Pseudobutyrivibrio sp. e Lactobacillus vitulinus were identified among the isolates. One of the isolates did not present satisfactory identification. It was possible to evaluate that the two different diets did not cause significant changes in the bacterial community profile. The comparison between both identification methods showed that the biochemical kits utilized during this research should not be used for the identification of ruminal bacteria. The sequencing of the the DNA region that encodes the 16S rRNA is still the safest form of identification. The identification of potencially cellulolytic and xylanolytic isolates as Selenomonas ruminantium and Lactobacillus vitulinus presents new evidence of the fibrolytic activity in individuals from those species. More studies are needed so as to verify the phytase expression by those bacteria. The results in this study are important for better comprehension of the rumen ecosystem and, in the future, could
contribute to improvements in the industrial hydrolysis of lignocellulosic material.
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