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Previous issue date: 2014-02-24 === O objetivo principal desse trabalho foi analisar os efeitos da alta pressão hidrostática (HHP) à membrana citoplasmática de leveduras, através da utilização da técnica decitometria de fluxo. Células de Saccharomyces cerevisiae Y440 Mat a, leu2 tiveram seu crescimento e viabilidade celular avaliados por citometria de fluxo. Após submetidas a pressões de 50, 100, 150 e 200 MPa analisou-se as características morfológicas das células. Os danos causados à membrana citoplasmática foram observados através do uso dos corantes Brometo de Etídio, Bis-Oxonol e Iodeto de Propídio. Os resultados encontrados mostram que a Citometria de Fluxo baseada em dados óticos de espalhamento de luz pode ser utilizada como uma técnica relativa de contagem de células, mas não como uma técnica absoluta, devido à presença dos brotamentos. Os corantes SYTO 9 e Alexafluor conjugado à Concanavalina não foram adequados para a discriminar as duas subpopulações formadas por células com e células sem brotamento. Os fluoróforos SYTO 9 e Iodeto de Propídio se mostraram apropriados para a análise de viabilidade celular, mostrando forte correlação com a técnica de plaqueamento. As pressões de 150 e 200 MPa causaram redução no tamanho celular das leveduras S. cerevisiae. Esses resultados são explicados pelos efeitos conhecidos da HHP às células, como a repressão da síntese de biomassa, maior empacotamento dos lipídios da membrana citoplasmática e interrupção do ciclo celular. Foi observado também redução na complexidade celular de S. cerevisiae. Estes resultados são atribuídos à degradação dos componentes internos das leveduras, gerada pela aplicação de pressões hidrostáticas letais. Quanto à fisiologia celular notou-se, a partir de 150 MPa, um aumento significativo dos danos causados pela HHP. A técnica BEBOXPI, não foi capaz de detectar células no estágio inicial de estresse, na qual as bombas citoplasmáticas se tornam inativas. A análise de fisiologia celular realizada apenas com os fluoróforos BOX e PI quando comparada aos resultados obtidos com o kit live/dead mostrou excelentes resultados. Ambas as técnicas forneceram dados iguais de porcentagem de células mortas, tanto nas amostras controle quanto nas amostras tratadas. Quanto às células vivas, enquanto o Live/dead detectou apenas a viabilidade das células, o BOXPI dividiu os dados referentes às células vivas em duas subpopulações: vivas/saudáveis e vivas/estressadas. Assim, foi possível através da citometria de fluxo obter dados mais aprofundados sobre os danos causados pela HHP, principalmente os referentes a despolarização da membrana citoplasmática.
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