Neuroproteção mediada pelo fator estimulador de colônias de granulócitos (G-CSF) em modelo de isquemia cerebral global de camundongos hipercolesterolêmicos

• Main Author: Peruch, Brunelli da Rós
• Other Authors: Silva, Cristina Martins e
• Format: Others
• Language: Portuguese
• Published: Mestrado em Bioquímica e Farmacologia 2016
• Subjects: Isquemia Cerebral; Crescimento Celular; Estresse oxidativo; Hipercolesterolemia; 61
• Online Access: http://repositorio.ufes.br/handle/10/1972

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O acidente vascular encefálico (AVE) é classicamente caracterizado como um déficit neurológico atribuído a uma lesão focal aguda do sistema nervoso central (SNC), por causa vascular, sendo uma das principais causas de invalidez e morte mundial. De todos os casos, 87% são de origem isquêmica. Os principais fatores de risco associados são idade, raça, aterosclerose, hiperlipidemia, tabagismo e outros. Até a presente data a terapia medicamentosa aprovada pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) e pelo Food and Drug Administration (FDA) para o tratamento do AVE isquêmico agudo é a utilização da classe dos agentes trombolíticos ativadores da fibrinólise. Várias citocinas parecem desempenhar um papel na neurogênese e/ou regeneração neuronal. Recentemente, estudos demonstraram que o fator estimulador de colônias de granulócitos (G-CSF) possui efeitos neuroprotetores em camundongos submetidos à isquemia cerebral, porém seus efeitos frente ao aumento do estresse oxidativo e à hipercolesterolemia/aterosclerose, uma das principais causas de AVE, ainda é desconhecido e foi o objeto deste estudo. Métodos. Foram utilizados camundongos knockout para a apolipoproteína E (ApoE-/-) e C57BL/6 machos, adultos jovens, com idade variando entre 12-14 semanas e pesando em média 28 g divididos em três grupos: controle ApoE-/-, tratado G-CSF ApoE-/- e controle C57BL/6. Todos os animais foram submetidos a oclusão das artérias carótidas comuns direita (temporária) e esquerda (permanente) seguida de administração de solução glicosada 5% (controles) e G-CSF 100μg/kg/dia (tratado) logo após e 24h depois da cirurgia. No terceiro dia após a oclusão os animais foram sacrificados e foi obtido o peso úmido do baço, coletada amostra de sangue e extraído o cérebro. As comparações estatísticas foram realizadas por teste t de Student e ANOVA de 1 via, seguida do post hoc de Fisher. Resultados e Discussão. A contagem de leucócitos circulantes no grupo G-CSF ApoE-/- apresentou-se estatisticamente superior (6661±1059 céls/mm3) quando comparado ao grupo controle ApoE-/- (4044±610 céls/mm3) e ao grupo controle C57BL/6 (3965±409 céls/mm3) evidenciando o efeito sistêmico do G-CSF no recrutamento e maturação de granulócitos sanguíneos. Na dosagem do colesterol total plasmático o G-CSF não reverteu a hipercolesterolemia dos animais ApoE-/-. A área macroscópica de infarto cerebral foi significativamente menor no grupo ApoE-/- tratado com G-CSF (0,03±0,01 cm2) quando comparado com o grupo ApoE-/- controle (0,18±0,03 cm2). Observou-se ainda diferença significativa quando comparamos a área de infarto do grupo controle C57BL/6 (0,08±0,02 cm2) com o grupo controle ApoE-/-. A força muscular, medida através do teste do agarre (grip force), estava significativamente diminuída nos animais controle ApoE-/- 48h pós-cirurgia quando comparados aos controles pré-cirúrgicos (de 97,9±9,8g para 70,69±10,62g), enquanto que no grupo G-CSF ApoE-/- a força registrada antes da cirurgia foi preservada no pós-cirúrgico. No ensaio para o estresse oxidativo plasmático o tratamento com G-CSF não alterou os parâmetros nos grupos ApoE-/- (controle = 23,76 ± 3,36 vs G-CSF = 23,0 ± 3,20 μMC-T/mg) que estavam estatisticamente aumentados quando comparados ao grupo controle C57BL/6 (3,97 ±1,22 μMC-T/mg). O teste do TUNEL (TdT-mediated-dUtp Nick End Labeling), para evidenciar a morte celular tecidual mostrou relação de células positivas/negativas menor no grupo tratado ApoE-/- quando comparado ao grupo controle ApoE-/-. A imunomarcação de neurônios e receptores de G-CSF mostrou estimulo a sobrevivência neuronal e maior presença de receptores no grupo tratado quando comparado ao controle. Conclusão. Nossos achados estão de acordo com a literatura e contribuem para evidenciar o efeito neuroprotetor do G-CSF, fortemente ligado a propriedade antiapoptótica, em modelo de isquemia cerebral global mesmo na presença do principal fator de risco para o AVE, a aterosclerose/hipercolesterolemia, e do aumento do estresse oxidativo. === Introduction. The stroke is classically characterized as a neurological deficit attributed to an acute focal lesion of the central nervous system (CNS), for vascular cause, and a major cause of disability and death worldwide. In all cases, 87% are ischemic. The main risk factors are age, race, atherosclerosis, hyperlipidemia, smoking, and others. To date drug therapy approved by the National Health Surveillance Agency (ANVISA) and the Food and Drug Administration (FDA) for the treatment of acute ischemic stroke is the use of the class of thrombolytic agents activators of fibrinolysis. Several cytokines appear to play a role in neurogenesis and /or neuronal regeneration. Recent studies have demonstrated that granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) has neuroprotective effects in mice subjected to cerebral ischemia, but its effects opposite to increased oxidative stress and hypercholesterolemia/atherosclerosis, a major cause of stroke, although is unknown and was the object of this study. Methods. Were used apolipoprotein E knockout (ApoE-/-) and C57BL/6 mice, male, young adults, aged between 12-14 weeks and weighing on average 28 g divided into three groups: control ApoE-/-, treated G-CSF ApoE-/- and control C57BL/6. All animals underwent occlusion of common carotid arteries (temporary) and left (standing) then administration of glucose solution 5% (controls) and G-CSF 100μg/kg/day (treated) just after and 24 hours following surgery. On the third day after occlusion the animals were sacrificed and the wet weight was obtained from the spleen, blood sample collected and extracted the brain. Statistical comparisons were performed by test t Student's and ANOVA 1 way, followed by Fisher's post hoc. Results and discussion. The count of circulating leukocytes in the G-CSF ApoE-/- group was statistically higher (6661 ± 1059 cells/ mm3) compared to the control ApoE-/- group (4044 ± 610 cells/mm3) and the control C57BL/6 group (3965 ± 409 cells/mm3) highlighting the systemic effect of G-CSF in the recruitment and maturation of blood granulocytes. In the measurement of plasma total cholesterol G-CSF did not reverse the hypercholesterolemia in ApoE-/- animals. The macroscopic area of cerebral infarction was significantly lower in group ApoE-/- treated with G-CSF (0.03 ± 0.01 cm2) compared with the group ApoE-/- control (0.18 ± 0.03 cm2). There was also significant difference in the infarcted area of control C57BL/6 group (0.08 ± 0.02 cm2) with the control ApoE-/- group. Muscle strength, measured by the grip test, was significantly reduced in ApoE-/- control animals 48 hours after surgery compared to preoperative controls (97.9 ± 9.8g for 70.69 ± 10,62g), while the group G-CSF ApoE-/- force recorded before surgery was preserved after surgery. In the assay for oxidative stress plasma treatment with G-CSF did not change the group parameters in ApoE-/- (control = 23,76±3,36 vs G-CSF = 23,0±3,20 μMC-T/mg) which was statistically increased compared to the C57BL/6 control group (3.97 ± 1.22 μMC-T/mg). The test TUNEL (TdT-mediated dUTP Nick End Labeling), to show the tissue cell death was related to positive cells/negative less in the group treated ApoE-/- as compared to the control group ApoE-/-. The immunostaining of neurons and G-CSF receptor showed stimulation for neuronal survival and increased presence of receptors in the treated group compared to the control. Conclusion. Our findings are in agreement with the literature and contribute to highlight the neuroprotective effect of G-CSF, strongly linked to antiapoptotic property in global cerebral ischemia model even in the presence of the major risk factor for stroke, atherosclerosis/hypercholesterolemia, and of increased oxidative stress.