| Summary: | Orientadora : Profa. Dra. Maria Fátima Grossi de Sá === Coorientador : Prof. Dr. Carlos Ricardo Soccol e Dr. Dijair Antonino de Souza Júnior === Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia. Defesa: Curitiba, 29/04/2016 === Inclui referências : f.75-86 === Área de concentração === Resumo: Os sequenciamentos dos transcritomas de Anthonomus grandis (Bicudo-do-algodoeiro) e de Telchin licus licus (Broca-gigante da cana-de-açúcar) possibilitaram o descobrimento e caracterização de novos genes possivelmente envolvidos na degradação da parede celular vegetal. A partir de contigs destes transcritomas foram selecionados genes que possuíam similaridade com enzimas envolvidas na degradação de biomassa vegetal. Foram elas: (1) uma provável endo-beta-1,4-glucanase [(EGase), EC 3.2.1.4], da família glicosil-hidrolase 45 (GHF45), a qual denominou-se AgEG1, por sua proveniência de A. grandis; e (2) uma provável xilose-redutase (XR) da família Aldo-ceto redutase 2 (AKR2), que foi chamada TlXR1 por ser oriunda de T. licus. Foram realizadas RT-PCRs a partir de RNA originado do intestino médio destes insetos utilizando-se primers específicos para amplificar os genes estudados. Inicialmente, estes genes foram clonadas no vetor pGEM-T easy para propagação e sequenciamento. Após o sequenciamento, para o gene AgEG1 foi obtida uma sequência de tamanho esperado de 650 pb, com proteína predita de 214 aminoácidos; para o TlXR1 obteve-se uma sequência de tamanho de 980 pb e a sequência proteica predita de 318 aminoácidos. Para validar a função destas proteínas, foi utilizada a levedura Pichia pastoris (cepas SMD1168 H e X33) para a expressão heteróloga das proteínas estudadas. Os genes sem a presença da sequência correspondentes ao peptídeo sinal foram clonados no vetor pGAPZ? B, e, consequentemente, introduzidos na levedura para expressão. A confirmação da expressão foi determinada mediante SDS-PAGE e Western blot. Para TlXR1, a expressão foi confirmada, com a presença de uma proteína de aproximadamente 35 kDa, compatível com o tamanho predito da enzima TlXR1, expressa na cepa X33. Entretanto, as condições para a expressão do gene AgEG1 ainda estão sendo determinadas. Os resultados deste trabalho confirmam a hipótese de que o gene TlXR1 é traduzido em uma proteína de tamanho esperado (candidata a uma xilose-redutase) quando expresso em P. pastoris. Os genes AgEG1 e TlXR1 podem estar envolvidos na degradação de biomassa vegetal; estes dois genes podem ser promissores para uma proposta visando a produção de biocombustíveis de segunda geração. Palavras-chave: Insetos -genes -enzimas -Pichia pastoris -expressão -proteínas -biocombustíveis. === Abstract: Transcriptome sequencing of Anthonomus grandis (Cotton Boll Weevil) and Telchin licus licus (Sugarcane Giant Borer) allowed the discovery and characterization of new genes possibly involved in the degradation of plant cell wall. Contigs from these transcriptomes were selected with similarity with enzymes involved in the degradation of plant biomass. We select: (1) a putative endo-beta-1.4-glucanase (EGase), EC 3.2.1.4, Glycoside Hydrolase family-45 (GHF45), which was named AgEG1, by their origin from A. grandis; and (2) a putative Xylose reductase (XR), an Aldo-Keto reductase from family 2 (AKR2), which was named TlXR1 because it is from T. licus. RT-PCRs were performed from RNA originated from midgut of these insects using specific primers to amplify the genes studied. Initially, these genes were cloned into pGEM-T easy vector to multiply and sequencing. After sequencing, for the AgEG1 gene was obtained a 650 bp sequence matching the expected size, and a predicted protein of 214 amino acids; for the TlXR1 it was obtained a 980 bp sequence and the predicted protein sequence has 318 amino acids. To validate the function of these proteins it was used the yeast Pichia pastoris (strains SMD1168H and X33) for heterologous expression of the studied proteins. The genes lacking the sequence corresponding to the signal peptide were cloned in pGAPZ? B vector, and, consequently, introduced into the yeast for expression. The confirmation of the expression was determined by SDS-PAGE and Western blot. For TlXR1, the expression was confirmed with the presence of an approximately 35 kDa protein, compatible with the predicted size of the TlXR. This protein was expressed in X33 strain. However, the conditions for the expression of the gene AgEG1 are still being determined. The results of this study confirm the hypothesis that the TlXR1 gene is translated into a protein of expected size (candidate for a Xylose reductase) when expressed in P. pastoris. AgEG1 and TlXR1 genes may be involved in the degradation of plant biomass. These two genes may be promising for a proposal aiming the production of second generation biofuels. Keywords: Insects - genes - enzymes - Pichia pastoris - expression - proteins - biofuels.
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