Resposta febril induzida por diferentes padrões moleculares associados a patógenos em ratos

• Main Author: Pereira, Amanda Leite Bastos
• Other Authors: Universidade Federal do Paraná. Setor de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia
• Format: Others
• Language: Portuguese
• Published: 2015
• Subjects: Farmacologia
• Online Access: http://hdl.handle.net/1884/38011

Orientador : Prof. Dr. Aleksander R. Zampronio === Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia. Defesa: Curitiba, 18/08/2014 === Inclui referências === Área de concentração === Resumo: A febre é um sinal comum em diversas doenças, sendo definida como um aumento controlado da temperatura corporal decorrente de uma alteração no controle térmico exercido pelo hipotálamo. A resposta febril é induzida por mediadores produzidos durante uma inflamação ou processo infeccioso. O modelo clássico de indução de febre é a administração de lipopolissacarídeo (LPS), proveniente da parede celular de bactérias gram-negativas, a animais de laboratório. Esse modelo está bem estabelecido no que diz respeito aos pirogênios endógenos envolvidos no processo, dentre eles fator de necrose tumoral (TNF)-?, interleucina (IL)-1?, IL-1?, IL-6, IL-8, proteína inflamatória de macrófago (MIP) 1? e ?, interferon (IFN) ? e ? e o quimioatraente neutrofílico induzido por citocinas (CINC)-1. A participação de mediadores centrais também está em grande parte estabelecida nesse modelo, e elementos tais como as prostaglandinas (PGs), sistemas opioide e canabinoide, substância P, endotelina (ET)-1 e fator liberador de corticotrofina (CRF) também estão envolvidos. O que não se sabe ao certo é se os mediadores envolvidos na resposta febril induzida por LPS também estão envolvidos na indução de febre em outros estados patológicos, pois há evidências de moléculas que induzem febre e não participam da resposta febril induzida pelo LPS. Assim, esse trabalho propôs a utilização de padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs), que estimulam uma resposta orgânica a partir da interação com receptores tipo Toll (TLR), a fim de estabelecer modelos de resposta febril em ratos, comparando-o com o LPS (que reconhece TLR4). Os PAMPs utilizados foram o Zimosan (agonista TLR2/6) e o Ácido Poliinosínico:Policitidílico (Poli I:C) (agonista TLR3). A participação das seguintes citocinas e mediadores centrais na resposta febril induzida por estes PAMPs foi avaliada: TNF-?, IL-1 ?, IL-6, IFN- (somente para Poli I:C), PGs, ET-1, substância P e opioides. Adicionalmente, investigamos se esses PAMPs ativariam importantes regiões cerebrais relacionadas à febre, a partir de cultivos primários neurogliais do Órgão Vascular da Lâmina Terminal (OVLT) (somente para o Zimosan) e do Núcleo Pré-Optico Mediano (MnPO). Também avaliamos se o estímulo com Zimosan levaria à produção de TNF-? e IL-6 em sobrenadantes desses cultivos celulares. As injeções intraperitoneais (i.p.) de Zimosan (1, 3 e 10 mg/kg) e de Poli I:C (3, 30 e 300 ?g/kg) levaram a um aumento na temperatura abdominal dose-dependente e coincidente com a diminuição na temperatura da pele desses animais, sugerindo a ativação de mecanismos de conservação de calor, presentes numa resposta febril. A administração intracerebroventricular (i.c.v.) de anticorpos contra TNF-? (2,5 ?g), IL-6 (10 ?g), IFN- (2,5 ?g) ou o antagonista do receptor de IL-1 (IL-1RA, 160 ng) reduziram as respostas febris induzidas por ambos os PAMPs. A injeção i.p. de Zimosan aumentou os níveis plasmáticos de IL-6 3 h após o estímulo, mas não os de TNF-? (após 1 h) ou IL-1 ? (após 2 h) no plasma ou das três citocinas no fluido cerebrospinal (CSF). A injeção de Poli I:C não alterou os níveis de citocinas no plasma ou CSF dos animais, nesses mesmos tempos de coleta. O tratamentos com inibidores da síntese de PGs, indometacina (2 mg/kg, i.p.) ou celecoxibe (5 mg/kg, via oral) reduziram as respostas febris induzidas pelos dois PAMPs. A injeção i.p. de Zimosan ou Poli I:C aumentou os níveis de PGE2 no CSF dos animais, que foi reduzido nos grupos prétratados com Indometacina. O antagonista do receptor opioide ?, CTAP (1 ?g), também reduziu as respostas febris induzidas pelo Zimosan e pelo Poli I:C. No entanto, o antagonista de receptores ETB, BQ788 (3 pmol) e o antagonista de receptores NK1, SR 140333B (3 ?g) reduziram somente a resposta febril induzida pelo Zimosan. Esses agentes não modificaram a resposta febril induzida por Poli I:C. O Zimosan, na concentração de 100 ?g/mL, aumentou a concentração intracelular de cálcio na OVLT e na MnPO de cultivos primários neurogliais, bem como aumentou a liberação de TNF-? e IL-6 nos sobrenadantes desses cultivos. O Poli I:C, na mesma concentração, aumentou a concentração intracelular de cálcio na MnPO. Esses dados sugerem a participação de TNF-?, IL-1?, IL-6, PGs e opioides, nas respostas febris induzidas por Zimosan e por Poli I:C, no cérebro. As endotelinas e a substância P parecem participar da resposta febril induzida pelo Zimosan, porém não pelo Poli I:C. A citocina IFN- também parece estar envolvida na resposta febril do Poli I:C. Adicionalmente, esses PAMPs podem diretamente ativar áreas cerebrais relacionadas a febre, conforme dados obtidos nos experimentos com cultivo primário neuroglial. Desse modo, existem diferenças na resposta febril induzida por LPS, comparada com o modelo de indução de febre viral (Poli I:C), pois alguns mediadores centrais não estão envolvidos na resposta febril desta. No que se diz respeito à resposta febril induzida pelo modelo de indução de febre fúngica, o Zimosan provavelmente compartilha mecanismos semelhantes ao da febre induzida por LPS, porém o tempo de liberação das citocinas após o estímulo com o Zimosan parece ser distinto. Como conclusão, chegamos a dois modelos de indução de resposta febril, distintos do modelo clássico, o induzido por LPS. Estes modelos poderão ser mais bem investigados, com relação aos demais mediadores de resposta febril. Futuramente, essas substâncias poderão servir como instrumentos de pesquisa para mecanismos fisiopatológicos de enfermidades e possíveis alvos terapêuticos. === Abstract: Fever is a common signal in several diseases, defined as a controlled increase in body temperature, with thermal control localized in the hypothalamus. Fever is induced by molecules which are produced during an inflammation or infection. The classical model of fever is the injection of lipopolysaccharide (LPS), derived from gram-negative bacteria, in laboratory animals. This model is well established, concerning endogenous pyrogens related to this process, such as Tumor Necrosis Factor (TNF)-?, Interleukin (IL)-1?, IL-1?, IL-6, IL-8, macrophage inflammatory protein (MIP) 1? e ?, interferon (IFN) ? e ? and cytokine-induced neutrophil chemoattractant (CINC)-1. The participation of central mediators is well elucidated in this model, and elements such as prostaglandins (PGs), opiodergic and cannabinoid systems, substance P, endothelin (ET)-1 and CRF seem to be present in this process. What is still unknown is whether LPS is valid as a fever-inducing model in other pathologic states, because there is some evidence of molecules which induce fever and do not participate in the LPS model. Hence, this work aimed to use pathogen-associated molecule patterns (PAMPs), which stimulate an organic response from their interaction with Toll-like receptors (TLRs), in order to establish febrile response models in rats, and then comparing them to LPS (which recongnizes TLR4). The chosen PAMPs were Zymosan (a TLR2/6 agonist) and Polyinosinic:Policitidilic acid (Poly I:C) (a TLR3 agonist). The role of the following cytokines and central mediators in these PAMPs-induced febrile responses was assessed: TNF-?, IL-1 ?, IL-6, IFN-? (only Poly I:C), PGs, ET-1, substance P and opioids. We also investigated if these PAMPs were able to activate fever-related brain regions, from primary neuroglial cultures of the vascular organ of the laminae terminalis (OVLT) (only Zymosan) and the median preoptic nucleus (MnPO). We also studied if Zymosan was capable to stimulate the production of TNF-? and IL-6 in supernadants from the same cellular cultures. Intraperitoneal (i.p.) injection of Zymosan (1, 3 and 10 mg/kg) and Poly I:C (3, 30 and 300 ?g/kg) led to an increase in core temperature, coincident to a decrease in skin temperature, suggesting heat conservation mechanisms, which are present in a febrile response. The intracerebroventricular (i.c.v.) administration of antibodies against TNF-? (2.5 ?g), IL-6 (10 ?g), IFN- (2.5 ?g) or the IL-1 antagonist receptor (IL-1RA, 160 ng) reduced both PAMPs-induced febrile responses. The Zymosan i.p. injection increased IL-6 plasmatic levels 3 hours after the stimulous, but not those of TNF-? (after 1 hour) nor IL-1 ? (after 2 hours). None of these cytokines had their CSF levels altered. The Poly I:C injection did not change these cytokines levels in CSF and plasma, at the same time collect points. The treatment with the PGs synthesis inhibitors, indometachin (2 mg/kg, i.p.) and celecoxib (5 mg/kg, by oral route) reduced the two PAMPs- induced febrile responses. The i.p. injection of both substances led to increases of PGE2 in the cerebrospinal fluid (CSF) of the animals, and these increases were reduced in the Indomethacin pre-treated groups. The ? opioid receptor antagonist, CTAP (1 ?g), reduced Zymosan and Poly I:C - induced febrile responses, as well. However, the ETB receptor antagonist, BQ788 (3 pmol) and the NK1 receptor antagonist, SR 140333B (3 ?g) were able to reduce only the Zymosan-induced febrile response. These substances did not change the Poly I:C-induced febrile response. Zymosan, in a 100 ?g/mL concentration, augmented the intracelular calcium signals in OVLT and MnPO from primary neuroglial cultures, as well as increased the TNF-? and IL-6 release from supernadants of these cultures. Poly I:C, at the same concentration, increased intracelular calcium signals in MnPO. Summarized, these data suggest the TNF-?, IL-1?, IL-6, PGs and opioids participation in the Zymosan and Poly I:C-induced febrile responses, in the brain. The ETs and substance P seem to participate only of the Zymosan fever, although not the Poly I:C one. Additionaly, these PAMPs may directly activate brain regions related to fever, as shown during primary neuroglial culture experiments. Thereby, there are significant diferences in the LPS-induced febrile response, compared to the viral fever model (Poly I:C), because some central mediators are not envolved in the last febrile response. Concerning the fungal model of febrile response induction, Zymosan probably shares similar mechanisms with LPS fever, although the cytokines time release seems to be different. As conclusion, we have now two models of febrile response induction, which are distinct from the classical model. These models can be better investigated, concerning the other febrile response central mediators. In the future, these substances can act as research tools to study pathophyisiological mechanisms and possible therapeutic targets.