| Summary: | Orientadora : Profª. Drª. Lia Sumie Nakao === Orientadora : Profª. Drª. Marcia Helena Appel === Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 2013 === Inclui referências === Área de concentração :Biologia === Resumo: Quiescina/sulfidril oxidase isoforma 1b (QSOX1b) é uma enzima secretada, e catalisadora da oxidação de proteínas nascentes e mal dobradas. Esta oxidação induz a formação de pontes dissulfeto, que são cruciais para a conformação e estabilidade de diversas proteínas. A literatura propõe que a oxidação de proteínas intra e extracelular, ou aquelas de superfície celular, acarreta em mudanças no estado redox destes microambientes, e também em alterações conformacionais das micro e macroestruturas proteicas. Baseado nisso, tivemos como objetivo analisar o papel de QSOX1b recombinante de camundongo (mQSOX1b) como possível oxidase da fibronectina (FN), uma glicoproteína dimérica de matriz extracelular (MEC). Através das determinações de peróxido de hidrogênio e de tióis em ensaios cinéticos com mQSOX1b e FN reduzida (redFN), in vitro, constatamos que redFN é oxidada pela enzima. A constante de Michaelis menten medida foi de aproximadamente 456 nM (com uréia) e 290 nM (sem uréia). redFN, per se, auto fibrila, produzindo multímeros solubilizados por deoxicolato (DOC), contudo, verificamos que mQSOX1b acelera a formação destes multímeros. Estas estruturas fibrilares possuem massa molecular maior que 800 kDa, e são desfeitas por agentes redutores, mas não são desfeitas por DOC (2%), indicando que são mantidas por pontes dissulfeto. Os multímeros não afetam a interação de redFN com gelatina, como indicado por imunoensaio. Coatings com multímeros de FN (nativa e reduzida) não alteraram a capacidade adesiva de Rasm (células musculares lisas de aorta de rato), HeLa (células de câncer cervical, Henrietta Lacks) ou 3t3 (Fibroblasto de camundongo), contudo, a proliferação foi aumentada quando Rasm e HeLa foram incubados sobre natFN junto a mQSOX1b. Ao analisar a superexpressão da mQSOX1b sobre o estado redox da MEC e superfície celular nas linhagens Hek293t (células de rim de embrião humano para transfecção) e HeLa, pudemos constatar a promoção do estado mais oxidado para estes ambientes. Sendo assim, propomos para QSOX1b funções biológicas sobre a formação e remodelamento de componentes da MEC, aqui demonstrado especificamente sobre FN. Sendo assim, a presença de QSOX1 pode estar associada com o controle do crescimento e sobrevivência celular, tanto em situações fisiológicas quanto patológicas. Palavras chaves: Quiescina/Sulfidril Oxidase 1b (QSOX1b); Matriz extracelular (MEC); Fibronectina (FN); oxidação; estado redox. === Abstract: Quiescin/Sulfhydryl Oxidase isoform 1b (QSOX1b) is a secreted enzyme, and
catalyzes the oxidation of nascent and misfolded proteins. This oxidation leads to the
formation of disulfide bonds which are critical to the conformation and stability of
various proteins. The literature suggests that oxidation of intra-and extracellular
proteins or those at cell surface leads to changes in the redox state of these
microenvironments, as well as conformational changes in the protein micro and
macrostructure. Based on that, we aimed to analyze the role of mouse recombinant
QSOX1b (mQSOX1b) as a possible oxidase for fibronectin (FN), a dimeric glycoprotein
of the extracellular matrix (ECM). In vitro, through enzyme kinetics assays and
measurement of thiols in the presence of mQSOX1b and reduced FN (redFN), we
found that redFN is oxidized by the enzyme. The KM values found were approximately
456 nM (urea) and 290 nM (without urea). FN multimers are also generated by auto
fibrillation and can be solubilized by deoxycholate (DOC), however, we found that the
QSOX1b accelerates the formation of these multimers. These fibrillar structures have
molecular mass greater than 800 kDa, and are lost in the presence of reducing agents
but not DOC (2%), indicating that multimers are maintained by disulfide bonds. The
multimers forms no affect the gelatin-redFN interaction, indicated by ELISA. Coatings
with multimers of FN (native and reduced FN) did not alter the adhesive capacity of
Rasm, HeLa or 3T3, however, the proliferation was increased when Rasm and HeLa
were incubated on natFN along mQSOX1b. Analyzing mQSOX1b overexpression
influence on the ECM redox state and cell surface protein thiols at HEK293T and HeLa
cells, we found more oxidized state for these environments. Therefore, we propose as
biological functions to QSOX1b the formation and remodeling ECM components, here
specifically FN. Thus, the presence of QSOX1 may be associated with cellular growth
and survival control, probably in physiological and pathological conditions.
Keywords: Quiescin/sulfhydryl oxidase 1b (QSOX1b), extracellular matrix (ECM),
fibronectin (FN); oxidation; redox state.
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