| Summary: | Orientadora : Profª Drª Vanete Thomaz-Soccol === Co-orientadora : Profª Drª Silvana Maria Alban === Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciencias Biológicas (Microbiologia, Parasitologia e Patologia Básica). Defesa: Curitiba,26/07/2014 === Inclui referências === Área de concentração: Parasitologia === Resumo:As leishmanioses são causadas por protozoários do gênero Leishmania Ross, 1903. Esta doença é uma das principais parasitoses negligenciadas, re-emergentes e afeta cerca de 350 milhões de indivíduos no mundo. O objetivo deste trabalho foi identificar peptídeos miméticos, para uso como antígenos em imunodiagnóstico e imunoprofilaxia da leishmaniose tegumentar americana (LTA). Bacteriófagos, expressando peptídeos em sua superfície, foram selecionados por imunoglobulinas específicas para Leishmania (Vianna) braziliensis (L. braziliensis). Posteriormente os mesmos foram submetidos à extração e sequenciamento do seu DNA. Três peptídeos (P-1, P-2 e P-3) foram identificados, sintetizados e inoculados individualmente ou combinados (MIX) em hamsters golden. Os animais imunizados com peptídeos produziram anticorpos que reconheceram diferentes proteínas do antígeno solúvel (AS) de L. braziliensis. A comparação das sequências dos três peptídeos, em banco de dados, demonstrou que elas apresentam homologia com glicoproteína de 63 kDa de Leishmania, lipofosfoglicano e com outras proteínas hipotéticas de Leishmania. Os peptídeos foram avaliados como antígenos no teste ELISA indireto. Dois grupos de pacientes foram investigados, sendo o primeiro constituído por 25 indivíduos que tiveram diagnóstico parasitológico confirmado e o segundo por 57 pacientes que apresentavam suspeita clínica de LTA, eram moradores de área endêmica e que tinham teste sorológico positivo para a doença. Os três peptídeos e o MIX foram imunorreativos contra soro de pacientes dos dois grupos. O peptídeo 1, 2, 3, MIX e AS reagiram com 64, 56, 44/56, 40/72 e 80% das amostras de soro, respectivamente. No Grupo 2, os três peptídeos só ou em combinação foram capazes de diagnosticar 82 a 84% dos indivíduos. Para obtenção do ponto de corte (Cut-off) entre soros positivos e negativos dois cálculos foram aplicados. O primeiro foi realizado calculando a média das absorbâncias obtidas para um grupo de indivíduos considerados negativos e acrescidos de dois desvios padrão (2SD) e o segundo foi empregando a Curva ROC (Receiver Operating Characteristics). As sensibilidades do teste ELISA utilizando os peptídeos foram de 64 a 74% para o peptídeo 1, 56 a 65% para o peptídeo 2, 44 a 68% para o peptídeo 3, 40 a 79% para o MIX e de 80 e 91% para o AS. O MIX de peptídeos apresentou o melhor desempenho (79% de sensibilidade) entre os peptídeos seguido do P-1 (74%). A aplicação do teste t sugeriu que o P-1 seria melhor alternativa entre os peptídeos para o diagnóstico da LTA. As especificidades dos antígenos variaram de 92 a 100% demonstrando a habilidade destes em diagnosticar corretamente os indivíduos sadios. Reações cruzadas com soros de pacientes com doença de chagas, hanseníase e tuberculose foram avaliadas contra todos os antígenos. A reação cruzada com soro de pacientes com doença de chagas foi 0% para o P-1 enquanto que para o AS foi 60%. Os peptídeos sintéticos também foram testados em ensaios de imunoproteção contra leishmaniose experimental (LE) em hamsters. Foi possível observar que os animais do grupo controle positivo (que receberam o desafio com L. braziliensis e não receberam peptídeos) apresentaram lesões específicas de LE, enquanto que os animais imunizados com os peptídeos individualmente ou em combinação não apresentaram lesões ou as apresentaram em menor número. Os animais que receberam o peptídeo 2 não desenvolveram lesões. Promastigotas de L. braziliensis foram isoladas, em meio de cultura, da pata, baço e fígado de animais de todos os grupos, com exceção do grupo dois e do grupo controle negativo. Essas análises demonstram que a metodologia selecionada para a realização dessa pesquisa foi adequada, visto que sequências peptídicas com homologia aos principais fatores de virulência de Leishmania sp. foram obtidas, resultados promissores em testes sorológicos de diagnóstico foram alcançados e imunoproteção de animais contra a leishmaniose experimental foi observada. Palavras-chave: Phage display. leishmaniose. ELISA. Vacinas. === Abstract: Leishmaniosis are caused by protozoan parasites of the genus Leishmania Ross, 1903. This is one of the main neglected, re-emerging parasitic diseases and affects about 350 million people worldwide. The objective of this study was to identify mimetic peptides to use as antigens in immunodiagnosis and immunoprophylaxis of American Cutaneous Leishmaniosis (ACL). Bacteriophages expressing peptides on their surface were selected by specific immunoglobulins for Leishmania (Vianna) braziliensis (L. braziliensis). Subsequently, they were subjected to DNA extraction and sequencing. Three peptides (P-1, P-2 e P-3) were identified, synthesized and individually or combined (MIX) inoculated in Golden hamsters. Animals immunized with peptides produced antibodies that recognized different proteins from the Soluble Antigen (SA) from L. braziliensis. Comparison of the sequences of the three peptides in database showed that they have similarity with a 63 kDa glycoprotein of Leishmania, a lipophosphoglycan and other hypothetical proteins of Leishmania. The peptides were evaluated as antigens in indirect ELISA. Two groups of patients were studied: the first consists of 25 individuals who had confirmed parasitological diagnosis and the second group of 57 patients who had clinical suspicion of ACL and were residents of endemic area and also had a positive serologic test for the disease. The three peptides and the MIX were immunoreactive against sera of patients in both groups. Peptide 1, 2, 3, MIX and AS were reactive with 64, 56, 44/56, 40/72 and 80% sera samples, respectively. In Group 2, the three peptides alone or in combination were able to diagnose 82 a 84% of individuals. In order to obtain the cut-off between positive and negative sera, two calculations were applied. The first one was conducted by calculating the mean absorbance obtained for a group of individuals considered negative plus two standard deviations (2SD). The second calculation was using the ROC curve (Receiver Operating Characteristics). The sensibility of the ELISA assay using the peptides were 64 to 74% for peptide 1, 56 to 65% for peptide 2, 44 to 68% for peptide 3, 40 to 79% for the MIX and 80 to 91% for the SA. The MIX of peptides showed the best performance (79%) among the peptides followed by P-1 (74%). The application of the t-test suggested that P-1 was the best alternative among the peptides for the diagnosis of ACL.The specificities of antigens ranged from 92% to 100% demonstrating the ability to correctly diagnose the healthy individuals. Cross-reactions with sera from patients with Chagas disease, leprosy and tuberculosis were evaluated against all antigens. Cross-reactivity with Chagas disease was zero for the P-1 and 60% for SA. The synthetic peptides were also tested in assays of immune protection against experimental Leishmaniosis (EL) in hamsters. It was possible to observe that the animals in the positive control group (that received a challenge with L. braziliensis and did not receive peptides) presented specific lesions of EL, whereas animals immunized with the peptides alone or in combination presented a few or no lesions. The animals receiving the peptide 2 did not develop lesions. Promastigotes of L. braziliensis were isolated in culture medium from the paw, spleen and liver from animals of all groups except group 2 and negative control group. These analysis show that the methodology selected for this study was appropriate. Since peptide sequences with homology to the main virulence factors of Leishmania sp. were obtained, promising results in serological diagnostic tests were achieved and immune protection of animals against EL was observed. Keywords: Phage display. Leishmaniosis. ELISA. Vaccines.
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